Chemische Komponente aus Edelstahl-Spiralrohr 310 10*1 mm. Die N-terminalen Domänen von Spidroin bilden Hydrogele auf Basis von Amyloidfibrillen und bieten eine Plattform für die Proteinimmobilisierung.

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Spezifikation

Lieferanten von Spiralrohren aus Edelstahl 310 10*1 mm

Chemische Zusammensetzung

Mechanische Eigenschaften

Rekombinante Spinnenseidenproteine ​​(Spinnenseidenproteine) haben viele potenzielle Anwendungen bei der Entwicklung neuer Biomaterialien, aber ihre multimodale und aggregationsanfällige Natur macht es schwierig, sie zu erhalten und einfach zu verwenden.Hier berichten wir, dass rekombinante Miniatur-Spidroin-Proteine ​​und, was wichtig ist, die N-terminale Domäne (NT) selbst bei 37 °C schnell selbsttragende und transparente Hydrogele bilden.Fusionsproteine ​​bestehend aus NT und grün fluoreszierendem Protein oder Purinnukleosidphosphorylase bilden voll funktionsfähige Fusionsproteine.Hydrogele.Unsere Ergebnisse zeigen, dass rekombinante NT- und Fusionsproteine ​​hohe Expressionsausbeuten liefern und Hydrogelen attraktive Eigenschaften wie Transparenz, Gelierung ohne Vernetzung und direkte Immobilisierung aktiver Proteine ​​bei hoher Dichte verleihen.
Spinnen haben bis zu sieben verschiedene Sätze Seidendrüsen, von denen jeder eine bestimmte Seidenart produziert.Alle sieben Seidenarten bestehen aus etwa 6000 Resten langen Spinnenseidenproteinen (Spidroinen) und enthalten eine große zentrale Wiederholungsregion, die von sphärischen N- und C-terminalen Domänen (NT und CT) umgeben ist1,2.Die am häufigsten untersuchte Seidenart, die Primärampulle, wird von der Primärampullendrüse produziert.In dieser Drüse synthetisiert eine Monoschicht aus Epithelzellen Spidroin-Proteine ​​und sekretiert sie in das Lumen der Drüse, wo sie in löslicher Form (Dotierung) in extrem hohen Konzentrationen (30–50 % w/v) vorliegen3,4.Die Organisation und Konformation der wichtigsten ampullären Spidroinproteine ​​in der Drüse wurde diskutiert, aber die meisten experimentellen Beweise deuten auf das Vorhandensein einer allgemein helikalen und/oder zufälligen helikalen Konformation sowie mizellarer oder lamellarer Strukturen5,6,7,8,9,10 hin.Während die repetitiven Domänen die mechanischen Eigenschaften von Seidenfasern regulieren und β-Faltblatt-Nanokristalle und amorphe Strukturen bilden11,12,13,14,15, regulieren Enddomänen Seidenfasern als Reaktion auf sich ändernde Bedingungen entlang der Seidendrüse16,17,18.Durch die Kontrolle der Seidenbildung werden 19. Terminale Domänen evolutionär konserviert und ihre Funktion könnte allen Spidroin-Proteinen gemeinsam sein 2,20,21.Während der Passage durch die Drüse sinkt der pH-Wert von Spidroin von etwa 7,6 auf < 5,716 und steigt mit Scherung und Dehnung, die durch die Bewegung durch den sich allmählich verengenden Gang vermittelt werden.In Lösung ist CT ein α-helikales konstitutives paralleles Dimer17, aber als Reaktion auf niedrigen pH-Wert und Scherkräfte entfaltet sich CT und schaltet β-Schichten16, 17 um, was möglicherweise β-Schichten in den repetitiven Regionen von Convert 16 auslöst. NT sind unter Monomeren Monomer Bedingungen, die die Bedingungen im Lumen der Drüse widerspiegeln und die Löslichkeit von Spidroin vermitteln, aber bei verringertem pH-Wert führt die Protonierung einer Reihe von Carbonsäureseitenketten zur Dimerisierung von NT mit einem pKa von etwa 6,5, wodurch NT stabilisiert und Spidroin im Großen und Ganzen fixiert wird Mengen.Netzwerke16,18.Somit spielt NT eine Schlüsselrolle bei der Filamentbildung und wandelt sich von einem Monomer in der Beschichtung zu einem Dimer in der Faser23,24,25.NT bleibt unter allen bisher untersuchten Bedingungen hochlöslich und helikal16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, was seine Entwicklung als löslichkeitssteigernde Markierung für die Produktion heterologer Proteine ​​inspirierte.
Rekombinantes Mini-Spinnenseidenprotein, bestehend aus einem NT, einer Short-Repeat-Region, einem CT und einem His6-Tag (His-NT2RepCT) zur Reinigung, ist in wässrigem Puffer genauso löslich wie natives Spinnenseidenprotein und ahmt native wichtige Eigenschaften der Seidenspinne nach .Berichterstattung 25.31.His-NT2RepCT kann mithilfe einer biomimetischen Maschine, in der eine lösliche Beschichtung mit einem pH-Wert von 8 in ein Wasserbad mit einem pH-Wert von 525, 32, 33, 34, 35 extrudiert wird, zu Endlosfasern gesponnen werden.Die Bioreaktor-Fermentation von E. coli, die His-NT2RepCT exprimieren, und die anschließende Nachbehandlung führten nach der Reinigung zu einer Ausbeute von >14 g/L.Die hohe Ausbeute, die hohe Löslichkeit und die angemessene Reaktion von His-NT2RepCT auf saure Bedingungen werden alle NT23, 25, 34 zugeschrieben.
Hier berichten wir über die schnelle Bildung transparenter Hydrogele aus rekombinanten Spidroin-Proteinen, einschließlich NT allein, durch Inkubation einer Proteinlösung bei 37 °C.Mithilfe der Thioflavin-T-Fluoreszenz (ThT), der Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) fanden wir heraus, dass NT- und Microspider-Proteine ​​eine strukturelle Umwandlung in β-Faltblätter und amyloidähnliche Fibrillen durchlaufen wenn Gele entstehen.Darüber hinaus bilden Fusionsproteine ​​aus NT und grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder Purinnukleosidphosphorylase (PNP) Hydrogele mit voll funktionsfähigen Fusionsfragmenten.Die Hochdurchsatzexpression in heterologen Wirten, gepaart mit der schnellen Bildung von Hydrogelen unter physiologischen Bedingungen, eröffnet die Möglichkeit einer kostengünstigen Produktion von Hydrogelen mit technischen Funktionen.
Im Gegensatz zu den meisten berichteten rekombinanten Spidroin-Proteinen36 ist His-NT2RepCT in Tris-HCl-Puffer bei pH 8 stabil und kann ohne Ausfällung auf bis zu 500 mg/ml konzentriert werden25.Daher waren wir überrascht, dass dieses Protein bei Inkubation bei 37 °C schnell optisch klare, selbsttragende Hydrogele bildet (Abb. 1b-d).Weitere Studien zeigten, dass die His-NT2RepCT-Gelierung über einen weiten Bereich von Proteinkonzentrationen (10–300 mg/ml) auftrat und dass diese Konzentration umgekehrt mit der Gelierungszeit korrelierte (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1).Um herauszufinden, welche Teile von His-NT2RepCT die Hydrogelbildung vermitteln, haben wir anschließend jede Domäne einzeln und in verschiedenen Kombinationen mithilfe eines Kolbenumkehrtests untersucht (Abbildung 1a,b).Alle getesteten Fraktionen von rekombinantem Spidroin bildeten in weniger als 1 Stunde Gele (bei einer Proteinkonzentration von 300 mg/ml), mit Ausnahme von präzipitiertem 2Rep (Abb. 1b).Dies deutet darauf hin, dass NT und CT allein, in Kombination oder in Verbindung mit Wiederholungen, bei 37 °C gelieren können und dass der His6-Tag diesen Prozess nicht wesentlich beeinflusst.Angesichts der weit verbreiteten Annahme, dass NT ein hochlösliches und stabiles Protein ist und dass frühere Berichte über rekombinante Spidroin-Hydrogele Gelbildungseffekte auf Konformationsänderungen in Wiederholungsregionen und/oder CTs zurückgeführt haben, könnte NT selbst dies tun.Die Entdeckung der Gelierung war unerwartet.Ergänzungstabelle 1) 37, 38, 39. Bemerkenswerterweise gelierte NT bereits bei einer Konzentration von ≥ 300 mg/ml innerhalb von 10 Minuten (Abb. 1c).Fläschcheninversionsexperimente mit verschiedenen NT-Konzentrationen zeigten, dass die NT-Lösung bei >50 mg/ml schneller gelierte als His-NT2RepCT bei der entsprechenden Konzentration (w/v, Abbildung 1c).
Schematische Darstellung verschiedener in dieser Arbeit untersuchter Spidroin-Konstrukte.b Gelierzeit bei 37 °C für verschiedene rekombinante Spidroin-Proteine ​​(300 mg/ml), verifiziert durch Umdrehen des Fläschchens.CT-Gel sofort ohne Inkubation (<300 mg/ml), 2Rep fällt aus (300 mg/ml, 5-mm-Maßstab).c Gelzeit von His-NT2RepCT und NT bei den angegebenen Proteinkonzentrationen bei 37 °C.d Fotos von His-NT2RepCT- und NT-Hydrogelen mit der Spinne bzw. dem darunter aufgedruckten Buchstaben „NT“ (beide 200 mg/ml, Maßstabsbalken 5 mm).
Hydrogele, die aus verschiedenen rekombinanten Spidroin-Proteinen gebildet werden, haben leicht unterschiedliche Farben und die Betrachtung mit bloßem Auge zeigt unterschiedliche Grade der Transparenz (Abb. 1b).NT-Gele sind außergewöhnlich klar, während andere Gele undurchsichtig werden.In zylindrische Röhrchen gegossene His-NT2RepCT- und NT-Gele konnten intakt aus der Form entnommen werden (Abb. 1d).
Um zu testen, ob natürliche Spinnenseidenbeschichtungen unter Bedingungen gelieren, von denen jetzt festgestellt wurde, dass sie eine Gelierung der rekombinanten Spidroin-Proteine ​​verursachen, wurden Beschichtungen aus der großen Ampullendrüse der Schwedischen Brückenspinne (Larinioides sclopetarius) gesammelt.Die Beschichtungen wurden in 20 mM Tris-HCl-Puffer bei 50 mg/ml (basierend auf dem gemessenen Trockengewicht) gelagert, während der 21-tägigen Inkubation bei 37 °C wurde jedoch keine Gelierung beobachtet (ergänzende Abbildung 2a).
Um diese Gele zu quantifizieren, können rheologische Messungen verwendet werden, um den Gelierungsprozess zu untersuchen und die gesamten mechanischen Eigenschaften zu bestimmen.Insbesondere die Überwachung des Speichermoduls (Elastizität) bei erhöhten Temperaturen kann Aufschluss über die Geliertemperatur sowie die viskoelastischen Eigenschaften der Beschichtung geben.Temperaturanstiegsexperimente (mit 1 °C/Minute bei 25–45 °C, basierend auf früheren Studien mit Stammlösungen aus natürlicher Seide)40,41 zeigten, dass die Speichermodule von His-NT2RepCT- und NT-Lösungen mit zunehmender Temperatur zunahmen.wurde erhöht (Abb. 2 und ergänzende Abb. 3).Bemerkenswert ist, dass das NT-Modul im Vergleich zu His-NT2RepCT bei einer niedrigeren Temperatur zu wachsen begann, was mit der schnelleren Gelzeit übereinstimmt, die beobachtet wurde, als NT direkt mit His-NT2RepCT bei 37 °C inkubiert wurde (Abbildung 1).Nach einem anschließenden Temperaturabfall kehrte der Speichermodul nicht auf niedrigere Werte zurück und blieb über dem Verlustmodul (siehe ergänzende Abbildung 3), was auf eine thermisch irreversible stabile Gelierung hinweist.Nach der Gelierung lag der endgültige Elastizitätsmodul für His-NT2RepCT-Hydrogele bei einer Konzentration von 100–500 mg/ml zwischen 15 und 330 kPa, und der endgültige Elastizitätsmodul für NT-Hydrogele (100–500 mg/ml) lag zwischen 2 und 1400 kPa (Abb. 2 und vollständige Rampendaten) siehe ergänzende Abb. 3).
a Temperaturänderung während der Messung von His-NT2RepCT (300 mg/ml) und b NT (300 mg/ml) unter Schütteln.Die Pfeile zeigen den Temperaturtrend an und die hellere Schattierung der Daten des Speichermoduls zeigt Tests bei niedrigeren Drehmomentwerten für das Instrument als vom Hersteller angegeben, was die Ursache für die erhöhte Geräuschentwicklung ist.c Endmodulakkumulation von His-NT2RepCT und NT nach erhöhter Temperatur (100, 300 und 500 mg/ml).Alle Modulmesswerte werden mit einer Frequenz von 0,1 Hz erfasst.
Als mögliche Methode zur Untersuchung von Konformationsänderungen im Zusammenhang mit der Gelierung haben wir FTIR-Spektren von His-NT2RepCT und NT vor und nach der Gelierung bei 37 °C aufgezeichnet (Abbildung 3a,b).Wie erwartet entsprachen die Spektren von His-NT2RepCT- und NT-Lösungen Proteinen mit einer α-Helix/Random-Coil-Sekundärstruktur mit einer ausgeprägten Bande bei 1645 cm-1.Bei beiden Hydrogelen führte die Gelierung zur Bildung von zwei Armen in der mittleren I-Bande bei etwa 1617 cm-1 und 1695 cm-1 (Abb. 3a, b), was auf die Bildung antiparalleler β-Faltblattstrukturen hinweist.Diese Änderungen sind auch in den jeweiligen Gelierungsspektren der zweiten Ableitung und der Differenz deutlich zu erkennen (ergänzende Abbildung 4b).Die beiden Banden der NT-β-Schicht waren ausgeprägter als die von His-NT2RepCT, was darauf hindeutet, dass der Gesamtgehalt an β-Schicht-Banden im NT-Hydrogel höher war als der des NT2RepCT-Hydrogels.
a FTIR-Absorptionsspektren von His-NT2RepCT und b NT (beide 500 mg/ml) vor (Lösung) und nach (Gel) Inkubation bei 37 °C.c TEM-Bilder von resuspendierten 50 mg/ml NT2RepCT-Gelen und d NT.Maßstabsbalken 200 nm.e Faserdurchmesser von His-NT2RepCT- und NT-Hydrogelen.n = 100 gemessene Fibrillen, p < 0,0001.Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung.Die Mitte der Fehlerbalken ist der Mittelwert.Für die statistische Analyse wurde ein ungepaarter t-Test (zweiseitig) verwendet.f ThT-Fluoreszenz verschiedener rekombinanter Spidroin-Proteine ​​(100 mg/ml) bei 37 °C ohne Schütteln.g NT (100 mg/ml) Inokulationsexperimente aus 100 mg/ml NT-Gel mit 0 %, 5 %, 10 % und 20 % Samen.
Die Analyse des Gels mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) zeigte, dass das Hydrogel aus amyloidähnlichen Fibrillen besteht (Abb. 3c, 3d).NT-gebildete Fibrillen waren länglich (5–12 nm Durchmesser) und unverzweigt, während His-NT2RepCT-Fibrillen kürzer und deutlich breiter im Durchmesser waren (7–16 nm) (Abb. 3e).Diese Ergebnisse ermöglichten es uns, die Kinetik der Fibrose mithilfe des Thioflavin T (ThT)-Assays zu verfolgen.Bei allen rekombinanten Spidroin-Proteinen nahm das Fluoreszenzsignal zu, wenn die Proben bei 37 ° C inkubiert wurden (Abb. 3f, ergänzende Abb. 5a).In Übereinstimmung mit diesem Befund ergab die mikroskopische Untersuchung von NT und His-NT2RepCT unter Gelierungsbedingungen einen gleichmäßigen Anstieg der ThT-Fluoreszenz ohne merkliche lokale Anreicherung von ThT-positiven Aggregaten (ergänzende Abbildung 5b, c).Die Bildung von ThT-positiven Fibrillen ging nicht mit einem Anstieg der NT- und His-NTCT-Trübung einher (ergänzende Abbildung 5d), was bedeutet, dass sich ein Netzwerk von Fibrillen im Gel bilden konnte, ohne die Klarheit des Gels zu beeinträchtigen.Die Beimpfung durch Zugabe kleiner Mengen vorgeformter Fibrillen kann die Fibrillenbildung einiger Amyloide erheblich beschleunigen42,43,44, aber die Zugabe von 5 %, 10 % oder 20 % (Gew./Gew.) NT zu einer Lösung von NT-Hydrokoagulanzien.Seeding-Effekt (Abb. 3g).Möglicherweise liegt das daran, dass die Fibrillen im Hydrogel relativ fest sind und nicht als Keime verwendet werden können.
Das unerwartete Verhalten rekombinanter Spidroin-Proteine ​​bei hohen Temperaturen veranlasste weitere Untersuchungen der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR), um Konformationsänderungen im Zusammenhang mit der Gelbildung zu identifizieren.NMR-Spektren von His-NT2RepCT-Lösungen, die im Laufe der Zeit bei 37 °C aufgezeichnet wurden, zeigten, dass CT immer noch teilweise gefaltet war, während NT- und 2Rep-Signale verschwunden waren (Abb. 4a), was darauf hindeutet, dass es hauptsächlich NT und 2Rep waren, die die Bildung von His-NT2Rep teilweise kontrollierten. NT2RepCT-Hydrogel.Das CT-Signal wurde ebenfalls auf 20 % seiner ursprünglichen Intensität abgeschwächt, was darauf hindeutet, dass CT ebenfalls größtenteils fixiert und in die Hydrogelstruktur eingebaut ist.Für einen kleineren Teil des CT, der genauso mobil ist wie in der vorinkubierten Probe und daher durch Lösungs-NMR beobachtet wird, fehlen in den Spektren Signale für die ersten 10 strukturierten Reste, möglicherweise aufgrund der schwierigen Immobilisierung des gebundenen Teils von His-NT2Rep.Die NMR-Spektren des -Zustands von Hydrogelen -NT2RepCT zeigten das überwiegende Vorhandensein von α-Helices und β-Schichten und in geringerem Maße die zufällige Knäuelkonformation (Abb. 4b).Die Analyse der chemischen Verschiebung von Methioninresten, die nur in NT vorhanden sind, zeigte, dass diese Domäne in eine β-Faltblattstruktur umgewandelt wurde.Die zeitabhängigen Spektren von NT in Lösung zeigten eine gleichmäßige Abnahme der Signalintensität (Abb. 4c), und Festkörper-NMR von NT-Hydrogeln zeigte, dass die meisten NT-Reste in β-Faltblattstrukturen umgewandelt wurden (Abb. 4d).Die Konformation von 2Rep konnte aufgrund seiner Aggregationsneigung nicht separat bestimmt werden.Die Festkörper-NMR-Spektren der NTCT- und His-NT2RepCT-Hydrogele sahen jedoch sehr ähnlich aus (Abb. 4b; ergänzende Abb. 6b), was darauf hindeutet, dass 2Rep nur wenig zum strukturellen Teil des His-NT2RepCT-Hydrogels beitrug.Für CT-Hydrogele wurden α-Helices, β-Faltblätter und zufällige helikale Sekundärstrukturen gefunden (ergänzende Abbildung 6d).Dies deutet darauf hin, dass einige Teile des CT weiterhin α-Helices bleiben, während andere zu β-Faltblättern werden.Die Ergebnisse der NMR-Spektroskopie legen daher nahe, dass NT für die Hydrogelbildung wichtig ist und sich bei Fusion mit 2Rep und CT auch in eine β-Faltblatt-Konformation umwandelt.In Übereinstimmung damit haben wir kürzlich herausgefunden, dass sich wahrscheinlich in allen fünf Helices der NT-Domäne räumliche Amyloid-Reißverschlüsse bilden, und der Waltz-Algorithmus hat eine amyloidogene Region in Helix 1 vorhergesagt (Abb. 4e).
2D-Spektren von 15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT-Lösung vor (blau) und 19 Stunden nach der Inkubation (rot) bei 37 °C.Einzelne Kreuzpeaks im roten Spektrum und F24, G136, PolyA im blauen Spektrum werden durch Aminosäuresymbole und Restnummern aus einzelnen Buchstaben gekennzeichnet.Die Einschübe zeigen die Abhängigkeit der Signalintensität von der Zeit für ausgewählte Reste aus den NT-, 2Rep- und CT-Domänen.b Festkörper-Hochfrequenzspektren (RFDR) von His-NT2RepCT-Hydrogelen.Korrelationen von Cα/Cβ-Resten, die in RFDR-Spektren beobachtet wurden, wurden durch Vergleich mit chemischen Verschiebungen des Modellpeptids und aus Statistiken82,83 abgeleiteten Werten und ihren Sekundärstrukturen bestimmt.SSB – rotierendes Seitenband.c Eindimensionale Spektren von 15N-HSQC 10 mg/ml NT-Lösung während der Inkubation bei 37 °C für 36 Stunden.Der Einschub zeigt die volumetrische Intensität im Verhältnis zur Zeit.d Festkörper-RFDR-Spektren von NT-Hydrogelen.Die in den RFDR-Spektren beobachteten Korrelationen der Cα/Cβ-Reste und ihrer Sekundärstrukturen sind angegeben.e Basierend auf dem NT45.79-Fibrillationsneigungsprofil aus der Zipper-Datenbank (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Die Rosetta-Energie des räumlichen Blitzverschiebungsfensters des Hexapeptids wird in kcal/mol angezeigt.Rote Balken kennzeichnen Hexapeptide mit hoher Fibroseneigung (Rosetta-Energie unter -23 kcal/mol; unterhalb der gepunkteten Linie).Grüne Balken weisen auf Fragmente hin, deren Rosetta-Energien über dem Schwellenwert liegen und daher weniger wahrscheinlich sterische Reißverschlüsse bilden.Prolinhaltige Fragmente wurden von der Analyse ausgeschlossen (ohne Säulen).Quadrate zeigen Bereiche mit Amyloidose an, die vom Waltz-Algorithmus81 (https://waltz.switchlab.org) vorhergesagt wurden.Die Reihenfolge der Aminosäurereste von NT befindet sich oben, und die Arten von Resten, die in der β-Sekundärstruktur gefunden werden (bestimmt durch Festkörper-NMR-Spektroskopie), sind in Rot dargestellt.Die Positionen der fünf NT-α-Helices werden als (H1-H5)28 bezeichnet.
Bei einem pH-Wert <6,5 dimerisiert HT und ist resistent gegen hitze- oder harnstoffinduzierte Denaturierung18.Um zu klären, wie sich NT-Dimerisierung und -Stabilität auf die Gelierung auswirken, wurden Lösungen mit 100 mg/ml NT mithilfe des Fläschchen-Inversionstests auf pH 8, 7 und 6 kontrolliert.NT-Proben, die bei pH 8 und 7 inkubiert wurden, gelierten nach 30 Minuten bei 37 °C, aber das Gel mit pH 8 blieb klar, während das Gel mit pH 7 einen sichtbaren Niederschlag zeigte (Abb. 5a).Im Gegensatz dazu bildete eine Lösung mit HT bei pH 6 kein Gel und nach 20 Minuten bei 37 °C war ein großer Niederschlag zu erkennen.Dies legt nahe, dass Dimere selbst und/oder ihre höhere Stabilität im Vergleich zu Monomeren die Gelierung verhindern.Die Bildung eines Niederschlags für NT bei pH 7 und 6 war nicht zu erwarten, da berichtet wurde, dass NT bei 200 mg/ml27 löslich ist, sich nach Hitzedenaturierung leicht wieder faltet und auch bei niedrigeren Werten eine α-Helix behält pH 18. Eine wahrscheinliche Erklärung für diese Diskrepanzen ist, dass die zuvor berichteten Experimente bei Raumtemperatur oder darunter oder bei relativ niedrigen Proteinkonzentrationen durchgeführt wurden16,18,19.
NT-Fläschchen-Inversionstest (100 mg/ml) bei pH 8, 7, 6 und 154 mM NaCl (pH 8) nach Inkubation bei 37 °C.b NT-CD-Spektren mit und ohne 154 mM NaF bzw. 154 mM NaCl.Die molare Elliptizität bei 222 nm wird in einen Anteil natürlicher Falten umgewandelt.c NT-Inversionsassay (100 mg/ml) NT* (37 °C und 60 °C), NTA72R (37 °C) und His-NT-L6 (37 °C und 60 °C).d CD-Spektren der NT-Mutanten NT*, NTA72R und His-NT-L6.Die molare Elliptizität bei 222 nm wird in einen Anteil natürlicher Falten umgewandelt.e Inversionstest von NTFlSp, NTMiSp und reduziertem NTMiSp (100 mg/ml).Maßstabsleiste 5 mm.f CD-Spektren von NT, NTFlSp, NTMiSp und reduziertem NTMiSp.Die molare Elliptizität bei 222 nm wird in einen Anteil natürlicher Falten umgewandelt.Vollständige NT-Spektren bei 25 °C und 95 °C sind in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt.
Die physiologische Salzkonzentration bestimmt die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen NT-Untereinheiten und die Dimerisierung der NT-Übertragung auf einen niedrigeren pH-Wert18.Wir fanden heraus, dass die Anwesenheit von 154 mM NaCl und NaF tatsächlich die Gelierung hemmte (Abb. 5a, b; ergänzende Abb. 2b) und dass diese Salze die thermische Stabilität von NT-Monomeren erhöhten (Abb. 5b, ergänzende Abb. 8). .Es deutet auch darauf hin, dass eine Stabilitätserhöhung und nicht eine Dimerisierung die Gelbildung verhindert.
Um die Rolle der Proteindimerisierung und -stabilität bei der Gelierung weiter zu untersuchen, verwendeten wir zwei Mutanten, NT* und NTA72R, die auch bei niedrigem pH-Wert von 28,30 Monomer bleiben.NT* ist ein Mutant mit doppelter Ladungsumkehr, bei dem die scheinbare dipolare Ladungsverteilung des Monomers abgeflacht ist, was eine Dimerisierung verhindert und die Monomerstabilität drastisch erhöht.NTA72R ist ein geladener Dipol, aber Arg-substituiertes Ala befindet sich an der Dimergrenze, sodass Mutationen die für die Dimerisierung erforderlichen Wechselwirkungen der Untereinheiten beeinträchtigen.Bei der Inkubation bei 37 °C bildete NT* kein Hydrogel, während NTA72R 15 Minuten lang ein undurchsichtiges Gel bildete (Abb. 5c).Da sowohl NT* als auch NTA72R nicht dimerisieren können, sich aber in der Monomerstabilität unterscheiden (Abb. 5d), deuten diese Ergebnisse stark darauf hin, dass eine hohe thermodynamische Stabilität die Gelierung von NT verhindert.Dies wird auch durch die Tatsache gestützt, dass HT* ein Gel bildet, wenn es bei hoher Temperatur instabil ist (nach 8 Minuten bei 60 °C; Abb. 5c).Es wurde zuvor gezeigt, dass der hohe Methioningehalt in NT seine natürliche Faltung verflüssigt und dass sechs Met-zu-Leu-Ersatzstoffe (hier als His-NT-L6 bezeichnet) das NT46-Monomer stark stabilisieren.Basierend auf der Annahme, dass strukturelle Flexibilität für die NT-Gelbildung erforderlich ist, stellten wir fest, dass die stabile His-NT-L6-Mutante bei 37 °C nicht gelierte (Abbildung 5c, d).Allerdings bildete His-NT-L6 bei 60-minütiger Inkubation bei 60 °C auch ein Gel (Abb. 5c).
Die Fähigkeit von NT, sich in β-Faltblattstrukturen umzuwandeln und Hydrogele zu bilden, scheint für einige, aber nicht alle NT-Domänen von Spidroin zu gelten.NTs aus verschiedenen Seidenarten und Spinnenarten, Trichonephila clavipes (NTFlSp), bildeten trotz ihres relativ geringen Methioningehalts und ihrer hohen thermischen Stabilität Gele (Abb. 5e, f und Ergänzungstabelle 2).Im Gegensatz dazu bildete NT aus dem kleinen Ampullenprotein Spidroin aus Araneus ventricosus (NTMiSp) mit geringer thermischer Stabilität und hohem Methioningehalt keine Hydrogele (Ergänzungstabelle 2 und Abb. 5e, f).Letzteres kann mit dem Vorhandensein intramolekularer Disulfidbindungen zusammenhängen29,47.Wenn die Disulfidbindungen von NTMiSp reduziert wurden, bildete sich konsistent nach 10-minütiger Inkubation bei 37 ° C ein Hydrogel (Abb. 5e).Abschließend ist festzuhalten, dass die strukturelle Flexibilität ein wichtiges, aber nicht das einzige Kriterium für die Bildung eines Gels aus NT ist.Ein weiterer Faktor, der relevant sein könnte, ist die Neigung zur Bildung von Amyloidfibrillen. Die Analyse mit der Zipper-Datenbank und dem Waltz-Algorithmus zeigte einen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit zur Gelbildung und dem Vorhandensein amyloidogener Regionen sowie der Ausdehnung der vorhergesagten Regionen um sterische Reißverschlüsse zu bilden.Es bestand eine Korrelation (Ergänzungstabelle 2 und Ergänzungsabbildung 9).
Die Fähigkeit von NT, unter günstigen Bedingungen Fibrillen und Gele zu bilden, veranlasste uns zu der Hypothese, dass NT-Fusionen mit anderen Proteinfragmenten immer noch Gele mit voller Funktion der Fusionspartner bilden können.Um dies zu testen, haben wir grün fluoreszierendes Protein (GFP) bzw. Purinnukleosidphosphorylase (PNP) am C-Terminus des NT eingeführt.Die resultierenden Fusionsproteine ​​wurden in E. coli mit sehr hohen Endausbeuten exprimiert (150 mg/l und 256 mg/l Schüttelkolbenkulturen für His-NT-GFP bzw. His-NT-PNP), was mit den gezeigten Ergebnissen übereinstimmt für andere mit NT fusionierte Proteine ​​Ref.30. Die Fusionsproteine ​​His-NT-GFP (300 mg/ml) und His-NT-PNP (100 mg/ml) bildeten nach 2 Stunden und 6,5 Stunden bei 37 °C Gele und, was wichtig ist, der GFP-Anteil blieb unverändert.beobachtet nach der Gelierung, wobei >70 % der anfänglichen Fluoreszenzintensität nach der Gelierung verbleiben (Abb. 6a).Um die PNP-Aktivität in his-NT-PNP-Lösungen und -Gelen zu messen, mussten wir das Fusionsprotein mit NT verdünnen, da die enzymatische Aktivität des reinen Präparats bei Gelierungskonzentrationen außerhalb des Nachweisbereichs des Assays lag.Das mit einer Mischung aus 0,01 mg/ml His-NT-PNP und 100 mg/ml NT gebildete Gel behielt 65 % der anfänglichen enzymatischen Aktivität der vorinkubierten Proben bei (Abb. 6b).Das Gel blieb während der Messung intakt (Ergänzende Abbildung 10).
a Relative Fluoreszenzintensität vor und nach der Gelierung von His-NT-GFP (300 mg/ml) und einem umgedrehten Fläschchen mit His-NT-GFP-Hydrogel (300 mg/ml) unter sichtbarem und UV-Licht.Punkte zeigen Einzelmessungen (n = 3), Fehlerbalken zeigen Standardabweichung.Der Durchschnittswert wird in der Mitte der Fehlerbalken angezeigt.b Die PNP-Aktivität wurde durch fluorometrische Analyse unter Verwendung von Lösungen und Gelen ermittelt, die aus NT (100 mg/ml) und einer Mischung mit 0,01 mg/ml His-NT-PNP und 100 mg/ml New Taiwan Dollars bestanden.Der Einschub zeigt ein umgedrehtes Fläschchen mit einem Hydrogel, das His-NT-PNP enthält (5-mm-Maßstab).
Hier berichten wir über die Bildung von Hydrogelen aus NT und anderen rekombinanten Spidroin-Proteinen durch Inkubation einer Proteinlösung bei 37 °C (Abbildung 1).Wir zeigen, dass die Gelierung mit der Umwandlung von α-Helices in β-Schichten und der Bildung amyloidähnlicher Fibrillen verbunden ist (Abb. 3 und 4).Dieser Befund ist überraschend, da es sich bei NTs um gewundene, kugelförmige Fünf-Helix-Bündel handelt, die für ihre extrem hohe Löslichkeit und hohe Stabilität bei Konzentrationen > 200 mg/ml bei 4 °C über mehrere Tage hinweg bekannt sind27.Darüber hinaus falten sich NTs nach Hitzedenaturierung bei niedrigen Proteinkonzentrationen in µM leicht wieder zurück.Unseren Ergebnissen zufolge erfordert die Fibrillenbildung eine Kombination aus einer Proteinkonzentration von >10 mg/ml und einer leicht erhöhten Temperatur (Abb. 1).Dies steht im Einklang mit der Vorstellung, dass sich Amyloidfibrillen aus kugelförmig gefalteten Proteinen bilden können, die sich aufgrund thermischer Schwankungen unter physiologischen Bedingungen in einem teilweise entfalteten Zustand befinden 48 .Beispiele für Proteine, die diese Umwandlung durchlaufen, sind Insulin49,50, β2-Mikroglobulin, Transthyretin und Lysozym51,52,53.Obwohl NT im nativen Zustand eine α-Helix ist, sind etwa 65 % der Polypeptidkette mit der Bildung eines sterischen Reißverschlusses kompatibel (Abb. 4e) 45 .Da das Monomer dynamisch mobil ist46, kann es diese potenziell amyloidogenen Regionen bei mäßig erhöhten Temperaturen freilegen und bei hohen Konzentrationen des Gesamtproteins eine kritische Konzentration für die Bildung von Amyloidfibrillen erreichen54.Dieser Überlegung folgend fanden wir eine negative Korrelation zwischen der Spidroinkonzentration und der Gelierungszeit (Abb. 1c), und wenn die Monomer-NT-Konformation entweder durch Mutationen (NT*, His-NT-L6) oder durch Salzzugabe stabilisiert wird, kann dies verhindert werden Bildung von Hydrogelen (Abb. 5).
In den meisten Fällen verschwinden Amyloidfibrillen als Niederschlag aus der Lösung, unter bestimmten Bedingungen können sie jedoch Hydrogele bilden55,56,57.Hydrogelbildende Fibrillen haben typischerweise ein hohes Aspektverhältnis und bilden durch molekulare Verschränkung stabile dreidimensionale Netzwerke,55,58 im Einklang mit unseren Ergebnissen.Bei der Hydrogelbildung in vitro werden Proteine ​​häufig vollständig oder teilweise entfaltet, beispielsweise durch Einwirkung organischer Lösungsmittel, hoher Temperatur (70–90 °C) und/oder niedrigem pH-Wert (1,5–3,0)59,60,61,62.Die hier beschriebenen Spidroin-Hydrogele erfordern keine harte Verarbeitung und erfordern auch keine Vernetzungsmittel zur Stabilisierung der Hydrogele.
Es wurde zuvor berichtet, dass Spidroin-Wiederholungen und QDs, die während des Seidenspinnens offenbar einen β-Faltblattwechsel durchlaufen, Hydrogele bilden.Im Vergleich zu unseren Ergebnissen waren die Inkubationszeiten und/oder die Inkubationstemperaturen deutlich länger bzw. höher und die resultierenden Hydrogele waren häufig undurchsichtig (Abbildung 7 und Ergänzungstabelle 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Zusätzlich zu den schnellen Gelzeiten übertrafen NT-Hydrogele >300 mg/ml (30 %) alle anderen beschriebenen rekombinanten Spinnenseidenprotein-Hydrogele sowie natürliche Hydrogele wie Gelatine, Alginat (2 %), Agar (0,5 %). ) und Kollagen.(0,6 %) (Abbildung 7 und ergänzende Tabellen 1 und 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Die Gelzeit und der Elastizitätsmodul der Hydrogele in dieser Studie wurden mit anderen Hydrogelen auf Spidroinbasis und ausgewählten natürlichen Hydrogelen verglichen.Referenzen werden zusammen mit einer Beschreibung der Gelierungsbedingungen angegeben.APS Ammoniumpersulfat, Raumtemperatur.Daten 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Spinnen haben offenbar Methoden entwickelt, um zu verhindern, dass Spidroin während der Lagerung geliert.Trotz der hohen Proteinkonzentration in der Seidendrüse bedeutet die große Wiederholungsregion, die mit der terminalen Domäne verbunden ist, dass die scheinbare Konzentration von NT und CT in der Drüse an der Grenze dieser Studie etwa 10–20 mg/ml entspricht.erforderlich für die in vitro beobachtete Hydrogelbildung.Darüber hinaus stabilisierten ähnliche Konzentrationen von Salzen 16 NT, wie in Seidendrüsen (Abb. 5b).Die NT-Konformation wurde im Zytosol von E. coli untersucht und ergab, dass sie enger gefaltet ist als bei der Untersuchung in vitro, was ein weiterer Hinweis darauf ist, dass Salz oder andere Faktoren ihre Aggregation in vivo verhindern.Allerdings könnte die Fähigkeit von NTs, sich in β-Faltblattfibrillen umzuwandeln, für die Filamentbildung wichtig sein und sollte in zukünftigen Studien untersucht werden.
Zusätzlich zu den neuen Aspekten der NT-Amyloid-ähnlichen Fibrillen- und Hydrogelbildung, die in dieser Studie beobachtet wurden, zeigen wir auch, dass dieses Phänomen biotechnologische und biomedizinische Anwendungen haben könnte (Abb. 8).Als Machbarkeitsnachweis kombinierten wir NT mit GFP oder PNP und zeigten, dass das Fusionsprotein bei Inkubation bei 37 °C auch Hydrogele bildet und dass die GFP- und PNP-Fraktionen ihre Aktivität nach der Gelierung weitgehend behalten (Abbildung 6).Nukleosidphosphorylasen sind wichtige Katalysatoren für die Synthese von Nukleosidanaloga75, was unsere Entdeckung für die biopharmazeutische Industrie relevant macht.Das Konzept der Expression von Fusionsproteinen, die unter günstigen Bedingungen transparente Hydrogele bilden, ermöglicht die Herstellung funktionalisierter Hydrogele mit günstigen Eigenschaften für ein breites Anwendungsspektrum wie Enzymimmobilisierung, kontrollierte Arzneimittelfreisetzung und Tissue Engineering.Darüber hinaus sind NT und NT* effiziente Expressionsmarker30, was bedeutet, dass NT und seine Varianten für die Hochdurchsatzproduktion löslicher Fusionsproteine ​​und die anschließende Erzeugung immobilisierter Zielproteine ​​in 3D-Hydrogelen verwendet werden können.
NT ist löslich, α-helikal und bei niedrigen Konzentrationen (µM) und 37 °C stabil.Bei gleicher Temperatur, aber bei steigenden Konzentrationen (>10 mg/ml), bildet NT Gele, die aus amyloidähnlichen Fibrillen bestehen.NT-Fusionsproteine ​​bilden außerdem fibrilläre Gele mit voll funktionsfähigen Fusionsfragmenten, sodass verschiedene Proteine ​​mithilfe von NT in 3D-Hydrogelen immobilisiert werden können.Unten: NT (PDB: 4FBS) und Abbildungen von Fasernetzwerken und zugehörigen Proteinstrukturen (angenommen und nicht maßstabsgetreu gezeichnet, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Die Konstrukte (eine vollständige Liste einschließlich Aminosäuresequenzen finden Sie in der Ergänzungstabelle 4) wurden in das Plasmid pT7 kloniert und in E. coli BL21 (DE3) transformiert.E. coli, die manipulierte Plasmide enthielten, wurden in Luria-Brühe, ergänzt mit Kanamycin (70 mg/l), inokuliert und über Nacht bei 30 °C und 250 U/min gezüchtet.Die Kultur wurde dann 1/100 in LB-Medium, das Kanamycin enthielt, inokuliert und bei 30 °C und 110 U/min kultiviert, bis die OD600 0,8 erreichte.Für NMR-Studien wurden Bakterien in M9-Minimalmedium gezüchtet, das 2 g D-Glucose 13C (Aldrich) und 1 g Ammoniumchlorid 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) enthielt, um Proteine ​​mit Isotopen zu markieren.Senken Sie die Temperatur auf 20 Grad Celsius und induzieren Sie die Proteinexpression mit 0,15 mM Isopropylthiogalactopyranosid (Endkonzentration).Nach der Proteinexpression über Nacht wurden die Zellen 20 Minuten lang bei 7278 × g und 4 °C geerntet.Zellpellets wurden in 20 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendiert und bis zur weiteren Verwendung eingefroren.Aufgetaute Zellen wurden unter Verwendung eines Zellaufschlussgeräts (Maschinen der TS-Serie, Constant Systems Limited, England) bei 30 kPa lysiert.Anschließend wurden die Lysate 30 Minuten lang bei 4 °C und 25.000 g zentrifugiert.Für NTMiSp wurde das Pellet dann in 2 M Harnstoff, 20 mM Tris-HCl, pH 8, resuspendiert und 2 Minuten lang mit Ultraschall behandelt (2 s ein/aus, 65 %), dann erneut bei 25.000 xg und 4 °C zentrifugiert 30 Minuten.Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Säule geladen, mit 20 mM Tris-HCl, 2 mM Imidazol, pH 8, gewaschen und schließlich wurde das Protein mit 20 mM Tris-HCl, 200 mM Imidazol, pH 8, eluiert. Um NT2RepCT und zu erzeugen NTCT, Thrombin-Verdauung führt die Stelle (ThrCleav) zwischen His und NT ein.Thrombin-Spaltungsstellen sind auch in His-NT-ThrCleav-2Rep (produziert 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (produziert NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (produziert CT) und His-Thioredoxin-ThrCleav-NT vorhanden .* (produziert NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produziert NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produziert NTF1Sp) und His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produziert NTMiSp).Die Konstrukte wurden mit Thrombin (1:1000) verdaut und über Nacht bei 4°C mit 20 mM Tris-HCl, pH 8, unter Verwendung einer Spectra/Por-Dialysemembran mit einem Molekulargewichtsschwellenwert von 6–8 kDa dialysiert.Nach der Dialyse wird die Lösung auf eine Ni-NTA-Säule geladen und der Abfluss, der das gewünschte Protein enthält, wird gesammelt.Die Proteinkonzentrationen wurden durch Messung der UV-Absorption bei 280 nm unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten jedes Proteins bestimmt, mit Ausnahme von NTF1Sp, das den Bradford-Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendete.Die Reinheit wurde durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (4–20 %) und Coomassie-Brilliantblau-Färbung bestimmt.Die Proteine ​​wurden unter Verwendung von Zentrifugenfiltern (VivaSpin 20, GE Healthcare) bei 4000 xg mit einem Molekulargewichtsgrenzwert von 10 kDa in 20-Minuten-Zyklen konzentriert.
Tauen Sie die Proteinlösung auf und pipettieren Sie vorsichtig 150 µl in ein 1 ml klares Septumfläschchen (8 x 40 mm Thermo Scientific).Die Röhrchen wurden verschlossen und mit Parafilm versiegelt, um eine Verdunstung zu verhindern.Proben (n = 3) wurden bei 37 °C oder 60 °C inkubiert und regelmäßig umgedreht, um die Gelierung zu beobachten.Proben, die nicht gelierten, wurden mindestens eine Woche lang inkubiert.Reduzieren Sie NTMiSp-Disulfidbindungen mit 10 mM DTT pro 10 µM Protein.Um die Gelierung natürlicher Spinnenseidenbeschichtungen zu analysieren, wurde die Schwedische Brückenspinne geschnitten, die beiden ampullierten Hauptdrüsen wurden in 200 μl 20 mM Tris-HCl-Puffer pH 8 gegeben und geschnitten, um die Trennung der Beschichtung von den Drüsen zu ermöglichen..Der Inhalt der Drüsen wird in Puffer gelöst, 50 µl zur Bestimmung des Trockengewichts (durch Inkubation offener Fläschchen bei 60 °C bis zur Gewichtskonstanz) und 150 µl zur Gelierung bei 37 °C.
Die Messgeometrie/das Messwerkzeug besteht aus Edelstahl unter Verwendung einer parallelen Platte mit einem oberen Durchmesser von 20 mm und einem Spalt von 0,5 mm.Erhitzen Sie die Probe mit einer Edelstahl-Peltierplatte mit einer Geschwindigkeit von 1 °C pro Minute von 25 °C auf 45 °C und wieder auf 25 °C.Vibrationsmessungen wurden bei einer Frequenz von 0,1 Hz und im linear viskoelastischen Bereich des Materials bei einer Dehnung von 5 % und 0,5 % für Proben von 100 mg/ml bzw. 300–500 mg/ml durchgeführt.Verwenden Sie eine spezielle Feuchtigkeitskammer, um Verdunstung zu verhindern.Die Daten wurden mit Prism 9 analysiert.
Zur Erfassung von Infrarotspektren (IR) bei Raumtemperatur von 800 bis 3900 cm–1.Das ATR-Gerät sowie der Lichtweg durch das Spektrometer werden vor und während des Experiments mit trockener, gefilterter Luft gespült.Lösungen (500 mg/ml, um Wasserabsorptionspeaks in den Spektren zu minimieren) wurden auf die Kristalle pipettiert, und vor der Messung wurden Gele (500 mg/ml) gebildet und dann auf die Kristalle übertragen (n = 3).Es wurden 1000 Scans mit einer Auflösung von 2 cm-1 und einem Null-Arbeitszyklus von 2 aufgezeichnet. Die zweite Ableitung wurde mit OPUS (Bruker) unter Verwendung eines Glättungsbereichs von neun Punkten berechnet.Die Spektren wurden mit F. Menges „Spectragryph – Optical Spectroscopy Software“ auf den gleichen Integrationsbereich zwischen 1720 und 1580 cm-1 normiert.Bei der ATR-IR-Spektroskopie ist die Eindringtiefe eines Infrarotstrahls in eine Probe wellenzahlabhängig, was bei niedrigeren Wellenzahlen zu einer stärkeren Absorption führt als bei höheren Wellenzahlen.Diese Effekte wurden für die in den Abbildungen gezeigten Spektren nicht korrigiert.3, weil sie sehr klein sind (Ergänzende Abbildung 4).Korrigierte Spektren für diese Zahl wurden mit der Bruker OPUS-Software berechnet.
Grundsätzlich ist eine umfassende Quantifizierung der Proteinkonformationen nach zuverlässiger Entfaltung der Komponenten innerhalb des Amid-I-Peaks möglich.In der Praxis treten jedoch einige Hindernisse auf.Rauschen im Spektrum kann während der Entfaltung als (falsche) Peaks erscheinen.Darüber hinaus stimmt der Peak aufgrund der Wasserbiegung mit der Position des Amid-I-Peaks überein und kann für Proben, die eine große Menge Wasser enthalten, wie das hier untersuchte wässrige Gel, eine ähnliche Größe haben.Daher haben wir nicht versucht, den Amid-I-Peak vollständig zu zerlegen, und unsere Beobachtungen sollten nur zur Unterstützung anderer Methoden wie der NMR-Spektroskopie berücksichtigt werden.
Lösungen von 50 mg/ml NT und His-NT2RepCT wurden über Nacht bei 37 °C geliert.Das Hydrogel wurde dann mit 20 mM Tris-HCl (pH 8) auf eine Konzentration von 12,5 mg/ml verdünnt, gut geschüttelt und zum Aufbrechen des Gels pipettiert.Anschließend wurde das Hydrogel 10-fach mit 20 mM Tris-HCl (pH 8) verdünnt, 5 μl der Probe auf ein mit Formvar beschichtetes Kupfergitter aufgetragen und die überschüssige Probe mit Löschpapier entfernt.Die Proben wurden zweimal mit 5 µl MilliQ-Wasser gewaschen und 5 Minuten lang mit 1 % Uranylformiat gefärbt.Entfernen Sie überschüssigen Fleck mit saugfähigem Papier und trocknen Sie das Netz anschließend an der Luft.Die Bildgebung wurde an diesen Gittern mit einem FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN bei 100 kV durchgeführt.Die Bilder wurden mit 26.500-facher und 43.000-facher Vergrößerung mit einer Veleta 2k × 2k CCD-Kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Deutschland) aufgenommen.Für jede Probe (n = 1) wurden 10–15 Bilder aufgenommen.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) wurde zur Bildanalyse und Messung von Faserdurchmessern (n = 100, verschiedene Fasern) verwendet.Prism 9 wurde zur Durchführung ungepaarter t-Tests (zweiseitig) verwendet.Die mittleren His-NT2RepCT- und NT-Fibrillen betrugen 11,43 (SD 2,035) bzw. 7,67 (SD 1,389) nm.Das Konfidenzintervall (95 %) beträgt -4,246 bis -3,275.Freiheitsgrade = 198, p < 0,0001.
80 µl flüssige Proben mit 10 µM Thioflavin T (ThT) wurden dreifach (n = 3) unter statischen Bedingungen unter Verwendung von Corning 96-Well-Platten mit schwarzem Boden und klarem Boden (Corning Glass 3881, USA) gemessen.Fluoreszenzunterschiede wurden mit einem 440-nm-Anregungsfilter und einem 480-nm-Emissionsfilter (FLUOStar Galaxy von BMG Labtech, Offenburg, Deutschland) aufgezeichnet.Das ThT-Signal war weder gesättigt noch gelöscht, da Experimente mit unterschiedlichen ThT-Konzentrationen durchgeführt wurden, ohne dass sich die Signalintensität änderte.Notieren Sie die Absorption bei 360 nm für die Trübungsmessung.Für Animpfungsexperimente wurden 100-mg/ml-Gele bei 37 °C gebildet, resuspendiert und für die Animpfung in Molverhältnissen von 5 %, 10 % und 20 % verwendet.Die Daten wurden mit Prism 9 analysiert.
Bestände an His-NT2RepCT und NT >100 mg/ml auf Eis auftauen und durch einen 0,22-m-Filter filtern.Die Konzentrationen wurden durch Messung der Absorption bei 280 nm mit Nanodrop berechnet.In den Vertiefungen einer schwarzen, nicht bindenden Platte mit 96 Vertiefungen (Corning) und klarem Boden wurden die Proben auf 20 mg/ml in 20 mM Tris-HCl, pH 8, verdünnt und mit 5 μM ThT (Endkonzentration), Gesamtprobenkonzentration, gemischt 50 μl Volumen.Die Proben wurden alle 10 Minuten bei 37 °C auf einem CellObserver-Mikroskop (Zeiss) mit Durchlichtkanal und FITC-Anregungs- und Emissionsfiltersätzen für die ThT-Bildgebung abgebildet.Für die Abbildung wird ein 20x/0,4-Objektiv verwendet.Für die Bildanalyse wurden Zen Blue (Zeiss) und ImageJ (https://imagej.nih.gov/) verwendet.Gele wurden auch aus NT- und His-NT2RepCT-Lösungen mit einer Konzentration von 50 mg/ml, die 20 mM Tris pH 8 und 5 µM ThT enthielten, hergestellt und 90 Minuten bei 37 °C inkubiert.Die Gelstücke wurden in eine neue Vertiefung mit 20 mM Tris, pH 8 und 5 μM ThT in einer nicht bindenden schwarzen 96-Well-Platte mit klarem Boden überführt.Erfassen Sie grüne Fluoreszenz- und Hellfeldbilder mit 20-facher/0,4-facher Vergrößerung.ImageJ wurde für die Bildanalyse verwendet.
Lösungs-NMR-Spektren wurden bei 310 K mit einem 600 MHz Bruker Avance Neo-Spektrometer erhalten, das mit einer QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) ausgestattet war.NMR-Proben mit 10 mg/ml homogenem Protein, markiert mit 13C, 15N, gelöst in 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (w/v) NaN3, 5 % DO (v/v), (n = 1) .Chemische Verschiebungen von NT2RepCT bei pH 6,7 wurden verwendet, um Peak 23 im 2D-Spektrum von 15N-HSQC zuzuordnen.
Magic-Angle-Spinning-Solid-NMR-Spektren (MAS) von 13C, 15N-markierten Hydrogelen wurden mit einem Bruker Avance III HD-Spektrometer bei 800 MHz aufgezeichnet, das mit einer elektronenlosen 3,2-mm-13C/15N{1H}-Sonde ausgestattet war.Die Probentemperatur wurde mithilfe eines Gasstroms mit variabler Temperatur bei 277 K gesteuert. Zweidimensionale Dipolrotationsresonanzspektren (DARR)76 und Radiofrequenz-Rekonnektionsspektren (RFDR)77 wurden bei MAS-Frequenzen von 12,5 kHz bzw. 20 kHz aufgenommen.Die Kreuzpolarisation (CP) von 1H auf 13C wurde mit einer linearen Rampe von 60,0 auf 48,0 kHz bei 1H, 61,3/71,6 kHz bei 13C (bei 12,5/20 kHz MAS) und einer Kontaktzeit von 0,5–1 ms durchgeführt.Bei der Datenerfassung wurde die Spinal6478-Entkopplung bei 73,5 kHz verwendet.Die Erfassungszeit betrug 10 Millisekunden und die Zyklusverzögerung 2,5 Sekunden.Die in den RFDR-Spektren beobachteten einfach verknüpften Cα/Cβ-Korrelationen wurden auf der Grundlage der charakteristischen chemischen Verschiebungen vom Resttyp und der mehrfach verknüpften Korrelationen in den DARR-Spektren zugeordnet.
Die Zipper79-Datenbank (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) wurde verwendet, um Flattertendenzen und Rosetta-Energie für NT, NTFlSp und NTMiSp zu bewerten.Die Zipper-Datenbank berechnet Rosetta Energy80, die mehrere Funktionen der freien Energie kombiniert, um die Proteinstruktur zu modellieren und zu analysieren.Ein Energieniveau von -23 kcal/mol oder weniger weist auf eine hohe Neigung zur Fibrillierung hin.Die niedrigere Energie bedeutet mehr Stabilität der beiden β-Stränge in der Reißverschlusskonformation.Darüber hinaus wurde der Waltz-Algorithmus verwendet, um amyloidogene Regionen in NT, NTFlSp und NTMiSp Ref vorherzusagen.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Die NT-Proteinlösung wurde mit 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES)-Puffer bei pH 5,5 und 6,0 ​​gemischt, um den pH-Wert auf pH 6 bzw. 7 zu senken.Die endgültige Proteinkonzentration betrug 100 mg/ml.
Die Messungen wurden mit einem J-1500 CD-Spektrometer (JASCO, USA) unter Verwendung einer 300-μL-Küvette mit einem optischen Weg von 0,1 cm durchgeführt.Die Proteine ​​wurden in 20 mM Phosphatpuffer (pH 8) auf 10 μM (n = 1) verdünnt.Um die Proteinstabilität in Gegenwart von Salz zu analysieren, wurden Proteine ​​bei gleicher Konzentration (n = 1) in 20 mM Phosphatpuffer (pH 8) mit 154 mM NaF bzw. NaCl analysiert.Temperaturscans wurden bei 222 nm von 25 °C bis 95 °C mit einer Heizrate von 1 °C/min aufgezeichnet.Der Anteil nativ gefalteter Proteine ​​wurde anhand der Formel (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) berechnet.Zusätzlich wurden für jede Probe fünf Spektren von 260 nm bis 190 nm bei 25 °C und nach Erhitzen auf 95 °C aufgenommen.Fünf Spektren wurden gemittelt, geglättet und in molare Elliptizität umgewandelt.Die Daten wurden mit Prism 9 analysiert.
Die Fluoreszenzintensität von His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µl) wurde dreifach (n = 3) in 96-Well-Corning-Platten mit schwarzem transparentem Boden (Corning Glass 3881, USA) unter statischen Bedingungen gemessen.Messen Sie Proben mit einem fluoreszenzbasierten Plattenlesegerät mit einer Anregungswellenlänge von 395 nm und zeichnen Sie die Emission bei 509 nm vor der Gelierung und 2 Stunden später bei 37 °C auf.Die Daten wurden mit Prism 9 analysiert.
Das Purinnukleosidphosphorylase-Aktivitätstestkit (fluorometrische Methode, Sigma Aldrich) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.Um die Aktivität in Gelen und Lösungen zu messen, die His-NT-PNP enthalten, mischen Sie 10 ng His-NT-PNP mit 100 mg/ml NT auf ein Gesamtvolumen von 2 µL, da das Gel ein Signal über dem Nachweisintervall des Sets lieferte.Kontrollen für Gele und Lösungen ohne His-NT-PNP waren enthalten.Die Messungen wurden zweimal durchgeführt (n = 2).Nachdem die Aktivität gemessen wurde, wurde die Reaktionsmischung entfernt und das Gel fotografiert, um sicherzustellen, dass das Gel während der Messung intakt blieb.Die Daten wurden mit Prism 9 analysiert.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie in der Zusammenfassung der Nature-Studie, die mit diesem Artikel verlinkt ist.
Die Abbildungen 1 und 2 zeigen die Ausgangsdaten.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f und 6, Ergänzende Abbildungen.3, ergänzende Abb.5a, d, Zusatzabb.6 und ergänzende Abb.8. Daten Daten aus dieser Studie werden in der Zenodo-Datenbank https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653 gehostet.Die in dieser Studie erhaltenen NMR-Daten wurden im BMRBig-Repository unter der Eintrags-ID bmrbig36 veröffentlicht.Die Strukturen von GFP und PNP wurden PDB entnommen (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. und Johansson, J. Spinnen künstlicher Spinnenseide.National Chemical.Biologie.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Das Genom von Nephila clavipes verdeutlicht die Vielfalt der Spinnenseidengene und ihre komplexe Expression.Nationale Genette.49, 895–903 (2017).