Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com.Sie verwenden eine Browserversion mit eingeschränkter CSS-Unterstützung.Für ein optimales Erlebnis empfehlen wir die Verwendung eines aktualisierten Browsers (oder die Deaktivierung des Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer).Um einen kontinuierlichen Support zu gewährleisten, zeigen wir die Seite außerdem ohne Stile und JavaScript an.
Slider mit drei Artikeln pro Folie.Verwenden Sie die Schaltflächen „Zurück“ und „Weiter“, um durch die Folien zu navigieren, oder die Schaltflächen des Schiebereglers am Ende, um durch die einzelnen Folien zu navigieren.

317 Lieferanten von Spiralrohren aus Edelstahl

Tabelle der chemischen Zusammensetzung von Edelstahlmaterial

SPACA6 ist ein von Spermien exprimiertes Oberflächenprotein, das für die Gametenfusion während der sexuellen Fortpflanzung von Säugetieren von entscheidender Bedeutung ist.Trotz dieser grundlegenden Rolle ist die spezifische Funktion von SPACA6 kaum verstanden.Wir klären die Kristallstruktur der extrazellulären Domäne von SPACA6 mit einer Auflösung von 2,2 Å auf und enthüllen ein Zweidomänenprotein, das aus einem viersträngigen Bündel und Ig-ähnlichen β-Sandwiches besteht, die durch quasi-flexible Linker verbunden sind.Diese Struktur ähnelt IZUMO1, einem weiteren Gametenfusions-assoziierten Protein, was SPACA6 und IZUMO1 zu Gründungsmitgliedern der Superfamilie der befruchtungsassoziierten Proteine ​​macht, die hier als IST-Superfamilie bezeichnet wird.Die IST-Superfamilie wird strukturell durch ihr verdrehtes Vier-Helix-Bündel und ein Paar disulfidverknüpfter CXXC-Motive definiert.Eine strukturbasierte AlphaFold-Suche im menschlichen Proteom identifizierte weitere Proteinmitglieder dieser Superfamilie;Insbesondere sind viele dieser Proteine ​​an der Gametenfusion beteiligt.Die SPACA6-Struktur und ihre Beziehung zu anderen Mitgliedern der IST-Superfamilie bilden das fehlende Glied in unserem Wissen über die Fusion von Säugetier-Gameten.
Jedes menschliche Leben beginnt mit zwei getrennten haploiden Gameten: dem Sperma des Vaters und der Eizelle der Mutter.Dieses Sperma ist der Gewinner eines intensiven Selektionsprozesses, bei dem Millionen von Samenzellen den weiblichen Genitaltrakt passieren, verschiedene Hindernisse überwinden1 und einer Kapazitation unterzogen werden, die ihre Beweglichkeit und den Prozess der Oberflächenkomponenten2,3,4 verbessert.Auch wenn Spermium und Eizelle zueinander finden, ist der Prozess noch nicht abgeschlossen.Die Eizelle ist von einer Schicht aus Kumuluszellen und einer Glykoproteinbarriere namens Zona pellucida umgeben, durch die Spermien gelangen müssen, um in die Eizelle einzudringen.Spermatozoen nutzen eine Kombination aus Oberflächenadhäsionsmolekülen und membranassoziierten und sezernierten Enzymen, um diese letzten Barrieren zu überwinden5.Diese Moleküle und Enzyme werden hauptsächlich in der inneren Membran und der akrosomalen Matrix gespeichert und werden erkannt, wenn die äußere Membran der Spermien während der akrosomalen Reaktion lysiert wird6.Der letzte Schritt dieser intensiven Reise ist die Spermien-Ei-Fusion, bei der die beiden Zellen ihre Membranen zu einem einzigen diploiden Organismus verschmelzen7.Obwohl dieser Prozess für die menschliche Fortpflanzung bahnbrechend ist, sind die notwendigen molekularen Wechselwirkungen kaum verstanden.
Neben der Befruchtung von Gameten wurde auch die Chemie der Fusion zweier Lipiddoppelschichten eingehend untersucht.Im Allgemeinen ist die Membranfusion ein energetisch ungünstiger Prozess, der erfordert, dass ein Proteinkatalysator eine strukturelle Konformationsänderung durchläuft, die zwei Membranen näher zusammenbringt, ihre Kontinuität unterbricht und eine Fusion verursacht8,9.Diese Proteinkatalysatoren sind als Fusogene bekannt und wurden in unzähligen Fusionssystemen gefunden.Sie sind für den viralen Eintritt in Wirtszellen erforderlich (z. B. gp160 bei HIV-1, Spike bei Coronaviren, Hämagglutinin bei Influenzaviren)10,11,12 Plazenta (Syncytin)13,14,15 und Gameten-bildende Fusionen in niederen Eukaryoten ( HAP2/GCS1 in Pflanzen, Protisten und Arthropoden) 16,17,18,19.Fusogene für menschliche Gameten müssen noch entdeckt werden, obwohl sich mehrere Proteine ​​als entscheidend für die Anheftung und Fusion von Gameten erwiesen haben.Das von der Eizelle exprimierte CD9, ein Transmembranprotein, das für die Fusion von Maus- und menschlichen Gameten erforderlich ist, wurde als erstes entdeckt 21,22,23.Obwohl seine genaue Funktion unklar bleibt, scheint eine Rolle bei der Adhäsion, der Struktur von Adhäsionsherden auf Ei-Mikrovilli und/oder der korrekten Lokalisierung von Eizellenoberflächenproteinen wahrscheinlich 24,25,26.Die beiden typischsten Proteine, die für die Gametenfusion von entscheidender Bedeutung sind, sind das Spermienprotein IZUMO127 und das Oozytenprotein JUNO28. Ihre gegenseitige Assoziation ist ein wichtiger Schritt bei der Gametenerkennung und -adhäsion vor der Fusion.Männliche Izumo1-Knockout-Mäuse und weibliche Juno-Knockout-Mäuse sind völlig steril. In diesen Modellen gelangen Spermien in den perivitellinen Raum, aber Gameten verschmelzen nicht.In ähnlicher Weise wurde die Konfluenz verringert, wenn Gameten in In-vitro-Fertilisationsexperimenten beim Menschen mit Anti-IZUMO1- oder JUNO27,29-Antikörpern behandelt wurden.
Kürzlich wurde eine neu entdeckte Gruppe von Spermien-exprimierten Proteinen entdeckt, die phänotypisch IZUMO1 und JUNO20,30,31,32,33,34,35 ähneln.In einer groß angelegten Mutagenesestudie an Mäusen wurde das akrosomale Membran-assoziierte Protein 6 (SPACA6) von Spermien als essentiell für die Befruchtung identifiziert.Die Insertion des Transgens in das Spaca6-Gen erzeugt nicht fusionierbare Spermien, obwohl diese Spermien den perivitellinen Raum infiltrieren 36 .Nachfolgende Knockout-Studien an Mäusen bestätigten, dass Spaca6 für die Gametenfusion erforderlich ist 30,32.SPACA6 wird fast ausschließlich in den Hoden exprimiert und weist ein ähnliches Lokalisierungsmuster wie IZUMO1 auf, nämlich in der Intima der Spermien vor der akrosomalen Reaktion, und wandert dann nach der akrosomalen Reaktion in die äquatoriale Region 30,32.Spaca6-Homologe gibt es in einer Vielzahl von Säugetieren und anderen Eukaryoten 30 und ihre Bedeutung für die menschliche Gametenfusion wurde durch die Hemmung der menschlichen Befruchtung in vitro durch Resistenz gegen SPACA6 nachgewiesen 30 .Im Gegensatz zu IZUMO1 und JUNO bleiben die Details der Struktur, Wechselwirkungen und Funktion von SPACA6 unklar.
Um den grundlegenden Prozess, der der Verschmelzung menschlicher Spermien und Eizellen zugrunde liegt, besser zu verstehen und so zukünftige Entwicklungen in der Familienplanung und Fruchtbarkeitsbehandlung zu beeinflussen, haben wir strukturelle und biochemische SPACA6-Studien durchgeführt.Die Kristallstruktur der extrazellulären Domäne von SPACA6 zeigt ein Vier-Helix-Bündel (4HB) und eine Immunglobulin-ähnliche (Ig-ähnliche) Domäne, die durch quasi-flexible Regionen verbunden sind.Wie in früheren Studien vorhergesagt7,32,37 ähnelt die Domänenstruktur von SPACA6 der von menschlichem IZUMO1, und die beiden Proteine ​​​​haben ein ungewöhnliches Motiv gemeinsam: 4HB mit einer dreieckigen helikalen Oberfläche und einem Paar disulfidverknüpfter CXXC-Motive.Wir schlagen vor, dass IZUMO1 und SPACA6 nun eine größere, strukturell verwandte Superfamilie von Proteinen definieren, die mit der Gametenfusion assoziiert sind.Unter Verwendung der für die Superfamilie einzigartigen Merkmale führten wir eine umfassende Suche nach dem strukturellen menschlichen AlphaFold-Proteom durch und identifizierten weitere Mitglieder dieser Superfamilie, darunter mehrere Mitglieder, die an der Gametenfusion und/oder Befruchtung beteiligt sind.Es scheint nun, dass es eine gemeinsame Strukturfalte und Superfamilie von Proteinen gibt, die mit der Gametenfusion verbunden sind, und unsere Struktur liefert eine molekulare Karte dieses wichtigen Aspekts des menschlichen Gametenfusionsmechanismus.
SPACA6 ist ein Single-Pass-Transmembranprotein mit einem N-verknüpften Glykan und sechs mutmaßlichen Disulfidbindungen (Abbildungen S1a und S2).Wir exprimierten die extrazelluläre Domäne von menschlichem SPACA6 (Reste 27–246) in Drosophila-S2-Zellen und reinigten das Protein mithilfe von Nickelaffinitäts-, Kationenaustausch- und Größenausschlusschromatographie (Abb. S1b).Die gereinigte SPACA6-Ektodomäne ist sehr stabil und homogen.Die Analyse mittels Größenausschlusschromatographie kombiniert mit polygonaler Lichtstreuung (SEC-MALS) ergab einen Peak mit einem berechneten Molekulargewicht von 26,2 ± 0,5 kDa (Abb. S1c).Dies steht im Einklang mit der Größe der SPACA6-Monomer-Ektodomäne, was darauf hinweist, dass während der Reinigung keine Oligomerisierung stattgefunden hat.Darüber hinaus ergab die Zirkulardichroismus-Spektroskopie (CD) eine gemischte α/β-Struktur mit einem Schmelzpunkt von 51,3 °C (Abb. S1d, e).Die Entfaltung der CD-Spektren ergab 38,6 % α-helikale und 15,8 % β-strängige Elemente (Abbildung S1d).
Die SPACA6-Ektodomäne wurde mittels Random-Matrix-Seeding38 kristallisiert, was zu einem Datensatz mit einer Auflösung von 2,2 Å führte (Tabelle 1 und Abbildung S3).Unter Verwendung einer Kombination aus fragmentbasierter molekularer Substitution und SAD-Phasendaten mit Bromidexposition zur Strukturbestimmung (Tabelle 1 und Abbildung S4) besteht das endgültige verfeinerte Modell aus den Resten 27–246.Zum Zeitpunkt der Strukturbestimmung waren keine experimentellen oder AlphaFold-Strukturen verfügbar.Die SPACA6-Ektodomäne misst 20 Å × 20 Å × 85 Å, besteht aus sieben Helices und neun β-Strängen und weist eine verlängerte Tertiärfalte auf, die durch sechs Disulfidbindungen stabilisiert wird (Abb. 1a, b).Die schwache Elektronendichte am Ende der Asn243-Seitenkette weist darauf hin, dass es sich bei diesem Rest um eine N-verknüpfte Glykosylierung handelt.Die Struktur besteht aus zwei Domänen: einem N-terminalen Vier-Helix-Bündel (4HB) und einer C-terminalen Ig-ähnlichen Domäne mit einer dazwischen liegenden Gelenkregion (Abb. 1c).
a Struktur der extrazellulären Domäne von SPACA6.Streifendiagramm der extrazellulären Domäne von SPACA6, die Farbe der Kette vom N- zum C-Terminus von dunkelblau bis dunkelrot.Cysteine, die an Disulfidbindungen beteiligt sind, sind in Magenta hervorgehoben.b Topologie der extrazellulären Domäne von SPACA6.Verwenden Sie das gleiche Farbschema wie in Abbildung 1a.c Extrazelluläre SPACA6-Domäne.Die 4HB-, Scharnier- und Ig-ähnlichen Domänenstreifendiagramme sind jeweils orange, grün und blau gefärbt.Die Ebenen sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet.
Die 4HB-Domäne von SPACA6 umfasst vier Haupthelices (Helices 1–4), die in Form einer helikalen Helix angeordnet sind (Abb. 2a) und zwischen antiparallelen und parallelen Wechselwirkungen wechseln (Abb. 2b).Eine kleine zusätzliche eingängige Helix (Helix 1′) wird senkrecht zum Bündel gelegt und bildet mit den Helices 1 und 2 ein Dreieck. Dieses Dreieck ist in der helikal verdrillten Packung der relativ dichten Packung der Helices 3 und 4 leicht deformiert ( Abb. 2a).
4HB N-Klemmenleistendiagramm.b Draufsicht auf ein Bündel von vier Helices, wobei jede Helix am N-Terminus dunkelblau und am C-Terminus dunkelrot hervorgehoben ist.c Spiralraddiagramm von oben nach unten für 4HB, wobei jeder Rest als Kreis dargestellt ist, der mit einem Aminosäurecode aus einem Buchstaben beschriftet ist;Nur die vier Aminosäuren oben im Rad sind nummeriert.Unpolare Reste sind gelb gefärbt, polare ungeladene Reste sind grün gefärbt, positiv geladene Reste sind blau gefärbt und negativ geladene Reste sind rot gefärbt.d Dreieckige Flächen der 4HB-Domäne, mit 4HBs in Orange und Scharnieren in Grün.Beide Einschübe zeigen stäbchenförmige Disulfidbindungen.
4HB ist auf einem inneren hydrophoben Kern konzentriert, der hauptsächlich aus aliphatischen und aromatischen Resten besteht (Abb. 2c).Der Kern enthält eine Disulfidbindung zwischen Cys41 und Cys55, die die Helices 1 und 2 in einem oberen erhabenen Dreieck miteinander verbindet (Abb. 2d).Zwei zusätzliche Disulfidbindungen wurden zwischen dem CXXC-Motiv in Helix 1′ und einem anderen CXXC-Motiv an der Spitze der β-Haarnadel in der Gelenkregion gebildet (Abb. 2d).Ein konservativer Argininrest mit unbekannter Funktion (Arg37) befindet sich in einem hohlen Dreieck, das aus den Helices 1′, 1 und 2 besteht. Aliphatische Kohlenstoffatome Cβ, Cγ und Cδ Arg37 interagieren mit dem hydrophoben Kern und seine Guanidingruppen bewegen sich zyklisch zwischen den Helices 1′ und 1 über Wechselwirkungen zwischen dem Thr32-Rückgrat und der Seitenkette (Abb. S5a, b).Tyr34 erstreckt sich in den Hohlraum und hinterlässt zwei kleine Hohlräume, durch die Arg37 mit dem Lösungsmittel interagieren kann.
Ig-ähnliche β-Sandwich-Domänen sind eine große Superfamilie von Proteinen, die das gemeinsame Merkmal haben, dass zwei oder mehr mehrsträngige amphipathische β-Faltblätter über einen hydrophoben Kern interagieren 39. Die C-terminale Ig-ähnliche Domäne von SPACA6 weist das gleiche Muster auf und besteht aus zwei Schichten (Abb. S6a).Blatt 1 ist ein β-Faltblatt aus vier Strängen (Stränge D, F, H und I), wobei die Stränge F, H und I eine antiparallele Anordnung bilden und die Stränge I und D eine parallele Wechselwirkung eingehen.Tabelle 2 ist ein kleines antiparalleles doppelsträngiges Beta-Faltblatt (Stränge E und G).Zwischen dem C-Terminus der E-Kette und dem Zentrum der H-Kette (Cys170-Cys226) wurde eine interne Disulfidbindung beobachtet (Abb. S6b).Diese Disulfidbindung ist analog zur Disulfidbindung in der β-Sandwichdomäne von Immunglobulin40,41.
Das viersträngige β-Faltblatt verdreht sich über seine gesamte Länge und bildet asymmetrische Kanten, die sich in Form und Elektrostatik unterscheiden.Die dünnere Kante ist eine flache hydrophobe Umgebungsoberfläche, die sich von den übrigen unebenen und elektrostatisch unterschiedlichen Oberflächen in SPACA6 abhebt (Abb. S6b, c).Ein Halo aus freiliegenden Carbonyl-/Aminogruppen des Rückgrats und polaren Seitenketten umgibt die hydrophobe Oberfläche (Abb. S6c).Der breitere Rand ist von einem abgedeckten helikalen Segment bedeckt, das den N-terminalen Teil des hydrophoben Kerns blockiert und drei Wasserstoffbrücken mit der offenen polaren Gruppe des F-Kettenrückgrats bildet (Abb. S6d).Der C-terminale Teil dieser Kante bildet eine große Tasche mit einem teilweise freiliegenden hydrophoben Kern.Die Tasche ist aufgrund von drei Sätzen doppelter Argininreste (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 und Arg212-Arg214) und einem zentralen Histidin (His220) von positiven Ladungen umgeben (Abbildung S6e).
Die Gelenkregion ist ein kurzes Segment zwischen der helikalen Domäne und der Ig-ähnlichen Domäne und besteht aus einer antiparallelen dreisträngigen β-Schicht (Stränge A, B und C), einer kleinen 310-Helix und mehreren langen zufälligen helikalen Segmenten.(Abb. S7).Ein Netzwerk aus kovalenten und elektrostatischen Kontakten in der Gelenkregion scheint die Orientierung zwischen 4HB und der Ig-ähnlichen Domäne zu stabilisieren.Das Netzwerk lässt sich in drei Teile gliedern.Der erste Teil umfasst zwei CXXC-Motive (27CXXC30 und 139CXXC142), die ein Paar Disulfidbindungen zwischen der β-Haarnadel im Gelenk und der 1′-Helix in 4HB bilden.Der zweite Teil umfasst elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der Ig-ähnlichen Domäne und dem Gelenk.Glu132 im Gelenk bildet eine Salzbrücke mit Arg233 in der Ig-ähnlichen Domäne und Arg135 im Gelenk.Der dritte Teil umfasst eine kovalente Bindung zwischen der Ig-ähnlichen Domäne und der Gelenkregion.Zwei Disulfidbindungen (Cys124-Cys147 und Cys128-Cys153) verbinden die Scharnierschleife mit einem Linker, der durch elektrostatische Wechselwirkungen zwischen Gln131 und der funktionellen Rückgratgruppe stabilisiert wird und den Zugang zur ersten Ig-ähnlichen Domäne ermöglicht.Kette.
Die Struktur der SPACA6-Ektodomäne und einzelne Strukturen von 4HB- und Ig-ähnlichen Domänen wurden verwendet, um nach strukturell ähnlichen Datensätzen in Proteindatenbanken zu suchen 42 .Wir identifizierten Übereinstimmungen mit hohen Dali-Z-Werten, kleinen Standardabweichungen und großen LALI-Werten (letzterer ist die Anzahl strukturell äquivalenter Reste).Während die ersten 10 Treffer aus der vollständigen Ektodomänensuche (Tabelle S1) einen akzeptablen Z-Score von >842 aufwiesen, zeigte eine Suche nach 4HB oder Ig-ähnlicher Domäne allein, dass die meisten dieser Treffer nur β-Sandwiches entsprachen.eine allgegenwärtige Falte, die in vielen Proteinen vorkommt.Alle drei Suchanfragen in Dali ergaben nur ein Ergebnis: IZUMO1.
Es wird seit langem vermutet, dass SPACA6 und IZUMO1 strukturelle Ähnlichkeiten aufweisen7,32,37.Obwohl die Ektodomänen dieser beiden Gametenfusions-assoziierten Proteine ​​nur eine Sequenzidentität von 21 % aufweisen (Abbildung S8a), ermöglichten komplexe Beweise, einschließlich eines konservierten Disulfidbindungsmusters und einer vorhergesagten C-terminalen Ig-ähnlichen Domäne in SPACA6, frühe Versuche, eine zu bauen Homologiemodell von A einer SPACA6-Maus unter Verwendung von IZUMO1 als Vorlage37.Unsere Struktur bestätigt diese Vorhersagen und zeigt den wahren Grad der Ähnlichkeit.Tatsächlich teilen die Strukturen SPACA6 und IZUMO137,43,44 die gleiche Zwei-Domänen-Architektur (Abb. S8b) mit ähnlichen 4HB- und Ig-ähnlichen β-Sandwich-Domänen, die durch eine Gelenkregion verbunden sind (Abb. S8c).
IZUMO1 und SPACA6 4HB weisen gemeinsame Unterschiede zu herkömmlichen Spiralbündeln auf.Typische 4HBs, wie sie in SNARE-Proteinkomplexen gefunden werden, die an der endosomalen Fusion beteiligt sind 45,46, haben gleichmäßig verteilte Helices, die eine konstante Krümmung um eine Mittelachse beibehalten 47. Im Gegensatz dazu waren die helikalen Domänen sowohl in IZUMO1 als auch in SPACA6 verzerrt, mit variabler Krümmung und ungleichmäßige Packung (Abbildung S8d).Die Drehung, die wahrscheinlich durch das aus den Helices 1′, 1 und 2 gebildete Dreieck verursacht wird, bleibt in IZUMO1 und SPACA6 erhalten und wird durch dasselbe CXXC-Motiv auf Helix 1′ stabilisiert.Allerdings erzeugt die zusätzliche Disulfidbindung in SPACA6 (Cys41 und Cys55, die die Helices 1 und 2 oben kovalent verbinden) eine schärfere Spitze an der Spitze des Dreiecks, wodurch SPACA6 stärker verdreht ist als IZUMO1 und ausgeprägtere Hohlraumdreiecke aufweist.Darüber hinaus fehlt IZUMO1 Arg37, das in der Mitte dieses Hohlraums in SPACA6 beobachtet wird.Im Gegensatz dazu hat IZUMO1 einen typischeren hydrophoben Kern aus aliphatischen und aromatischen Resten.
IZUMO1 hat eine Ig-ähnliche Domäne, die aus einem doppelsträngigen und einem fünfsträngigen β-Faltblatt besteht43.Der zusätzliche Strang in IZUMO1 ersetzt die Spule in SPACA6, die mit dem F-Strang interagiert, um die Wasserstoffbrückenbindungen im Grundgerüst im Strang zu begrenzen.Ein interessanter Vergleichspunkt ist die vorhergesagte Oberflächenladung der Ig-ähnlichen Domänen der beiden Proteine.Die IZUMO1-Oberfläche ist negativer geladen als die SPACA6-Oberfläche.Eine zusätzliche Ladung befindet sich in der Nähe des C-Terminus gegenüber der Spermienmembran.In SPACA6 waren dieselben Regionen neutraler oder positiver geladen (Abb. S8e).Beispielsweise sind die hydrophobe Oberfläche (dünnere Kanten) und die positiv geladenen Vertiefungen (breitere Kanten) in SPACA6 in IZUMO1 negativ geladen.
Obwohl die Beziehung und die Sekundärstrukturelemente zwischen IZUMO1 und SPACA6 gut erhalten sind, zeigte die strukturelle Ausrichtung der Ig-ähnlichen Domänen, dass sich die beiden Domänen in ihrer allgemeinen Ausrichtung relativ zueinander unterscheiden (Abb. S9).Das Spiralbündel von IZUMO1 ist um das β-Sandwich gekrümmt, wodurch die zuvor beschriebene „Bumerang“-Form in einem Winkel von etwa 50° zur Mittelachse entsteht.Im Gegensatz dazu war der spiralförmige Strahl in SPACA6 um etwa 10° in die entgegengesetzte Richtung geneigt.Die Unterschiede in diesen Ausrichtungen sind wahrscheinlich auf Unterschiede im Scharnierbereich zurückzuführen.Auf der Ebene der Primärsequenz weisen IZUMO1 und SPACA6 mit Ausnahme der Cystein-, Glycin- und Asparaginsäurereste kaum Sequenzähnlichkeiten am Scharnier auf.Daher sind Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Netzwerke völlig unterschiedlich.Elemente der β-Faltblatt-Sekundärstruktur werden von IZUMO1 und SPACA6 gemeinsam genutzt, obwohl die Ketten in IZUMO1 viel länger sind und die 310-Helix (Helix 5) nur bei SPACA6 vorkommt.Diese Unterschiede führen zu unterschiedlichen Domänenorientierungen für zwei ansonsten ähnliche Proteine.
Unsere Suche auf dem Dali-Server ergab, dass SPACA6 und IZUMO1 die einzigen zwei experimentell bestimmten Strukturen sind, die in der Proteindatenbank gespeichert sind und diese spezielle 4HB-Faltung aufweisen (Tabelle S1).In jüngerer Zeit hat DeepMind (Alphabet/Google) AlphaFold entwickelt, ein auf neuronalen Netzwerken basierendes System, das die 3D-Strukturen von Proteinen anhand von Primärsequenzen genau vorhersagen kann48.Kurz nachdem wir die SPACA6-Struktur gelöst hatten, wurde die AlphaFold-Datenbank veröffentlicht, die prädiktive Strukturmodelle bereitstellt, die 98,5 % aller Proteine ​​im menschlichen Proteom abdecken48,49.Unter Verwendung unserer aufgelösten SPACA6-Struktur als Suchmodell identifizierte eine strukturelle Homologiesuche nach dem Modell im menschlichen AlphaFold-Proteom Kandidaten mit möglichen strukturellen Ähnlichkeiten zu SPACA6 und IZUMO1.Angesichts der unglaublichen Genauigkeit von AlphaFold bei der Vorhersage von SPACA6 (Abb. S10a) – insbesondere der 1,1 Å rms-Ektodomäne im Vergleich zu unserer aufgelösten Struktur (Abb. S10b) – können wir sicher sein, dass die identifizierten SPACA6-Übereinstimmungen wahrscheinlich genau sind.
Zuvor suchte PSI-BLAST nach dem IZUMO1-Cluster mit drei anderen Spermien-assoziierten Proteinen: IZUMO2, IZUMO3 und IZUMO450.AlphaFold sagte voraus, dass sich diese Proteine ​​der IZUMO-Familie mit demselben Disulfidbindungsmuster wie IZUMO1 in die 4HB-Domäne falten (Abbildungen 3a und S11), obwohl ihnen eine Ig-ähnliche Domäne fehlt.Es wird vermutet, dass IZUMO2 und IZUMO3 einseitige Membranproteine ​​sind, die IZUMO1 ähneln, während IZUMO4 sezerniert zu sein scheint.Die Funktionen der IZUMO 2-, 3- und 4-Proteine ​​bei der Gametenfusion wurden nicht bestimmt.Es ist bekannt, dass IZUMO3 eine Rolle bei der Akrosombiogenese während der Spermienentwicklung spielt51, und das IZUMO-Protein bildet einen Komplex50.Die Konservierung von IZUMO-Proteinen bei Säugetieren, Reptilien und Amphibien legt nahe, dass ihre potenzielle Funktion mit der anderer bekannter Gametenfusions-assoziierter Proteine ​​wie DCST1/2, SOF1 und FIMP übereinstimmt.
Diagramm der Domänenarchitektur der IST-Superfamilie, wobei 4HB-, Hinge- und Ig-ähnliche Domänen jeweils in Orange, Grün und Blau hervorgehoben sind.IZUMO4 hat eine einzigartige C-terminale Region, die schwarz aussieht.Bestätigte und mutmaßliche Disulfidbindungen werden durch durchgezogene bzw. gepunktete Linien dargestellt.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) und TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) werden im gleichen Farbbereich wie Panel A angezeigt. Disulfidbindungen werden in Magenta angezeigt.TMEM95-, IZUMO2- und IZUMO3-Transmembranhelices sind nicht dargestellt.
Im Gegensatz zum IZUMO-Protein wird angenommen, dass sich andere SPACA-Proteine ​​(d. h. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 und SPACA9) strukturell von SPACA6 unterscheiden (Abb. S12).Nur SPACA9 verfügt über 4HB, aber es wird nicht erwartet, dass es die gleiche Parallel-Antiparallel-Ausrichtung oder die gleiche Disulfidbindung wie SPACA6 aufweist.Nur SPACA1 hat eine ähnliche Ig-ähnliche Domäne.AlphaFold sagt voraus, dass SPACA3, SPACA4 und SPACA5 eine völlig andere Struktur haben als SPACA6.Interessanterweise spielt SPACA4 bekanntermaßen auch eine Rolle bei der Befruchtung, jedoch in größerem Maße als SPACA6, und erleichtert stattdessen die Interaktion zwischen Spermien und Eizelle Zona pellucida52.
Unsere AlphaFold-Suche hat eine weitere Übereinstimmung für IZUMO1 und SPACA6 4HB, TMEM95 gefunden.TMEM95, ein einzelnes spermienspezifisches Transmembranprotein, macht männliche Mäuse bei Ablation unfruchtbar 32,33.Spermien, denen TMEM95 fehlte, hatten eine normale Morphologie, Beweglichkeit und die Fähigkeit, die Zona pellucida zu durchdringen und sich an die Eimembran zu binden, konnten jedoch nicht mit der Eizellenmembran verschmelzen.Frühere Studien haben gezeigt, dass TMEM95 strukturelle Ähnlichkeiten mit IZUMO133 aufweist.Tatsächlich bestätigte das AlphaFold-Modell, dass TMEM95 ein 4HB mit demselben CXXC-Motivpaar wie IZUMO1 und SPACA6 und derselben zusätzlichen Disulfidbindung zwischen den Helices 1 und 2 ist, die in SPACA6 gefunden wurde (Abb. 3a und S11).Obwohl TMEM95 keine Ig-ähnliche Domäne aufweist, verfügt es über eine Region mit einem Disulfidbindungsmuster, das den Gelenkregionen SPACA6 und IZUMO1 ähnelt (Abb. 3b).Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung dieses Manuskripts meldete der Preprint-Server die Struktur von TMEM95 und bestätigte damit das AlphaFold53-Ergebnis.TMEM95 ist SPACA6 und IZUMO1 sehr ähnlich und ist evolutionär bereits bei Amphibien konserviert (Abb. 4 und S13).
Bei der PSI-BLAST-Suche wurden die Datenbanken NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP und SOF1 verwendet, um die Position dieser Sequenzen im Lebensbaum zu bestimmen.Abstände zwischen Verzweigungspunkten werden nicht maßstabsgetreu dargestellt.
Die auffällige allgemeine strukturelle Ähnlichkeit zwischen SPACA6 und IZUMO1 legt nahe, dass sie Gründungsmitglieder einer konservierten strukturellen Superfamilie sind, zu der die Proteine ​​TMEM95 und IZUMO 2, 3 und 4 gehören.bekannte Mitglieder: IZUMO1, SPACA6 und TMEM95.Da nur wenige Mitglieder Ig-ähnliche Domänen besitzen, ist das Markenzeichen der IST-Superfamilie die 4HB-Domäne, die einzigartige Merkmale aufweist, die allen diesen Proteinen gemeinsam sind: 1) Gewundenes 4HB mit Helices, die in einem antiparallelen/parallelen Wechsel angeordnet sind (Abb . 5a), 2) das Bündel hat eine dreieckige Fläche, die aus zwei Helices innerhalb des Bündels und einer dritten vertikalen Helix besteht (Abb. Schlüsselbereich (Abb. 5c). Es ist bekannt, dass das CXXC-Motiv, das in Thioredoxin-ähnlichen Proteinen vorkommt, funktioniert als Redoxsensor 54,55,56, während das Motiv in Mitgliedern der IST-Familie mit Proteindisulfid-Isomerasen wie ERp57 bei der Gametenfusion assoziiert sein kann. Rollen sind damit verbunden 57,58.
Mitglieder der IST-Superfamilie werden durch drei charakteristische Merkmale der 4HB-Domäne definiert: vier Helices, die zwischen paralleler und antiparalleler Ausrichtung wechseln, ba-dreieckige helikale Bündelflächen und ein ca. CXXC-Doppelmotiv, das zwischen kleinen Molekülen gebildet wird.) N-terminale Helixe (orange) und β-Haarnadel der Gelenkregion (grün).
Angesichts der Ähnlichkeit zwischen SPACA6 und IZUMO1 wurde die Fähigkeit des ersteren getestet, an IZUMO1 oder JUNO zu binden.Die Biolayer-Interferometrie (BLI) ist eine kinetische Bindungsmethode, die bereits zur Quantifizierung der Wechselwirkung zwischen IZUMO1 und JUNO verwendet wurde.Nach der Inkubation des Biotin-markierten Sensors mit IZUMO1 als Köder mit einer hohen Konzentration an JUNO-Analyt wurde ein starkes Signal festgestellt (Abb. S14a), was auf eine durch Bindung induzierte Änderung der Dicke des an der Sensorspitze befestigten Biomaterials hinweist.Ähnliche Signale (d. h. JUNO gekoppelt an den Sensor als Köder gegen den IZUMO1-Analyten) (Abb. S14b).Es wurde kein Signal festgestellt, wenn SPACA6 als Analyt gegen sensorgebundenes IZUMO1 oder sensorgebundenes JUNO verwendet wurde (Abbildung S14a,b).Das Fehlen dieses Signals weist darauf hin, dass die extrazelluläre Domäne von SPACA6 nicht mit der extrazellulären Domäne von IZUMO1 oder JUNO interagiert.
Da der BLI-Assay auf der Biotinylierung freier Lysinreste am Köderprotein basiert, kann diese Modifikation die Bindung verhindern, wenn Lysinreste an der Wechselwirkung beteiligt sind.Darüber hinaus kann die Ausrichtung der Bindung relativ zum Sensor zu sterischen Hindernissen führen, weshalb herkömmliche Pull-Down-Assays auch an den rekombinanten SPACA6-, IZUMO1- und JUNO-Ektodomänen durchgeführt wurden.Trotzdem fiel SPACA6 nicht mit His-markiertem IZUMO1 oder His-markiertem JUNO aus (Abb. S14c, d), was darauf hinweist, dass keine Interaktion mit der in BLI-Experimenten beobachteten übereinstimmt.Als Positivkontrolle bestätigten wir die Wechselwirkung von JUNO mit markiertem His IZUMO1 (Abbildungen S14e und S15).
Trotz der strukturellen Ähnlichkeit zwischen SPACA6 und IZUMO1 ist die Unfähigkeit von SPACA6, JUNO zu binden, nicht überraschend.Die Oberfläche von menschlichem IZUMO1 weist mehr als 20 Reste auf, die mit JUNO interagieren, einschließlich Reste aus jeder der drei Regionen (obwohl sich die meisten davon in der Gelenkregion befinden) (Abb. S14f).Von diesen Resten ist nur einer in SPACA6 (Glu70) konserviert.Während viele Restaustausche ihre ursprünglichen biochemischen Eigenschaften beibehielten, wurde der essentielle Arg160-Rest in IZUMO1 durch den negativ geladenen Asp148 in SPACA6 ersetzt;Frühere Studien haben gezeigt, dass die Arg160Glu-Mutation in IZUMO1 die Bindung an JUNO43 fast vollständig aufhebt.Darüber hinaus vergrößerte der Unterschied in der Domänenorientierung zwischen IZUMO1 und SPACA6 die Oberfläche der JUNO-Bindungsstelle der entsprechenden Region auf SPACA6 erheblich (Abb. S14g).
Trotz der bekannten Notwendigkeit von SPACA6 für die Gametenfusion und seiner Ähnlichkeit mit IZUMO1 scheint SPACA6 keine entsprechende JUNO-Bindungsfunktion zu haben.Deshalb haben wir versucht, unsere Strukturdaten mit Beweisen aus der Evolutionsbiologie zu kombinieren.Die Sequenzausrichtung von SPACA6-Homologen zeigt die Erhaltung der gemeinsamen Struktur über Säugetiere hinaus.Beispielsweise sind Cysteinreste auch bei entfernt verwandten Amphibien vorhanden (Abb. 6a).Mithilfe des ConSurf-Servers wurden mehrere Sequenz-Alignment-Retentionsdaten von 66 Sequenzen auf die SPACA6-Oberfläche abgebildet.Diese Art der Analyse kann zeigen, welche Reste während der Proteinevolution konserviert wurden und welche Oberflächenregionen eine Rolle bei der Funktion spielen.
a Sequenz-Alignment von SPACA6-Ektodomänen aus 12 verschiedenen Arten, hergestellt mit CLUSTAL OMEGA.Laut ConSurf-Analyse sind die konservativsten Positionen blau markiert.Cysteinreste sind rot hervorgehoben.Domänengrenzen und Sekundärstrukturelemente werden oben in der Ausrichtung angezeigt, wobei Pfeile auf β-Stränge und Wellen auf Helices hinweisen.Die NCBI-Zugriffskennungen, die die Sequenzen enthalten, sind: Mensch (Homo sapiens, NP_001303901), Mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), Kapuzineraffen (Cebus mimic, XP_017359366), Pferd (Equus caballus, XP_023506102), Schwertwal (Orcinus orca3_23 XP_03). 2_034) .), Schaf (Ovis aries, XP_014955560), Elefant (Loxodonta africana, XP_010585293), Hund (Canis lupus Familyis, XP_025277208), Maus (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanischer Teufel (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), Schnabeltier, 8 ) , 61_89 und Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Die Nummerierung orientiert sich an der menschlichen Reihenfolge.b Oberflächendarstellung der SPACA6-Struktur mit 4HB oben und Ig-ähnlicher Domäne unten, Farben basierend auf Erhaltungsschätzungen des ConSurf-Servers.Die am besten erhaltenen Teile sind in Blau, die mäßig erhaltenen Teile in Weiß und die am wenigsten erhaltenen in Gelb.lila Cystein.Im Einschub mit den Bezeichnungen 1, 2 und 3 sind drei Oberflächenflecken dargestellt, die ein hohes Schutzniveau aufweisen. Im Einschub oben rechts ist ein 4HB-Cartoon zu sehen (gleiches Farbschema).
Die SPACA6-Struktur weist drei hochkonservierte Oberflächenbereiche auf (Abb. 6b).Patch 1 erstreckt sich über 4HB und die Gelenkregion und enthält zwei konservierte CXXC-Disulfidbrücken, ein Arg233-Glu132-Arg135-Ser144-Gelenknetzwerk (Abb. S7) und drei konservierte äußere aromatische Reste (Phe31, Tyr73, Phe137)).ein breiterer Rand der Ig-ähnlichen Domäne (Abb. S6e), der mehrere positiv geladene Reste auf der Spermienoberfläche darstellt.Interessanterweise enthält dieses Pflaster ein Antikörperepitop, von dem zuvor gezeigt wurde, dass es die Funktion von SPACA6 30 beeinträchtigt.Region 3 erstreckt sich über das Scharnier und eine Seite der Ig-ähnlichen Domäne;Diese Region enthält konservierte Proline (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) und nach außen gerichtete polare/geladene Reste.Überraschenderweise sind die meisten Reste auf der Oberfläche von 4HB sehr variabel (Abb. 6b), obwohl die Faltung im gesamten SPACA6-Homolog (wie durch den Konservatismus des hydrophoben Bündelkerns angezeigt) und über die IST-Superfamilie hinaus konserviert bleibt.
Obwohl dies die kleinste Region in SPACA6 mit den wenigsten nachweisbaren Sekundärstrukturelementen ist, sind viele Überreste der Scharnierregion (einschließlich Region 3) unter den SPACA6-Homologen hoch konserviert, was darauf hindeuten könnte, dass die Ausrichtung des helikalen Bündels und des β-Sandwichs eine Rolle spielt.als Konservativer.Trotz umfangreicher Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatischer Netzwerke in der Gelenkregion von SPACA6 und IZUMO1 lassen sich jedoch Hinweise auf intrinsische Flexibilität in der Ausrichtung der mehreren erlaubten Strukturen von IZUMO137,43,44 erkennen.Die Ausrichtung der einzelnen Domänen überlappte gut, die Ausrichtung der Domänen zueinander variierte jedoch zwischen 50° und 70° von der Mittelachse (Abb. S16).Um die Konformationsdynamik von SPACA6 in Lösung zu verstehen, wurden SAXS-Experimente durchgeführt (Abb. S17a, b).Die Ab-initio-Rekonstruktion der SPACA6-Ektodomäne entsprach einer Stabkristallstruktur (Abb. S18), obwohl das Kratky-Diagramm ein gewisses Maß an Flexibilität zeigte (Abb. S17b).Diese Konformation steht im Gegensatz zu IZUMO1, bei dem das ungebundene Protein sowohl im Gitter als auch in Lösung eine Bumerangform annimmt43.
Um die flexible Region gezielt zu identifizieren, wurde an SPACA6 eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektroskopie (H-DXMS) durchgeführt und mit zuvor an IZUMO143 erhaltenen Daten verglichen (Abb. 7a, b).SPACA6 ist deutlich flexibler als IZUMO1, was durch einen höheren Deuteriumaustausch in der gesamten Struktur nach 100.000 s Austausch angezeigt wird.In beiden Strukturen zeigt der C-terminale Teil der Gelenkregion ein hohes Maß an Austausch, was wahrscheinlich eine begrenzte Rotation von 4HB- und Ig-ähnlichen Domänen relativ zueinander ermöglicht.Interessanterweise ist der C-terminale Teil des SPACA6-Gelenks, bestehend aus dem 147CDLPLDCP154-Rest, eine hochkonservierte Region 3 (Abb. 6b), was möglicherweise darauf hinweist, dass die Flexibilität zwischen Domänen ein evolutionär konserviertes Merkmal von SPACA6 ist.Laut der Flexibilitätsanalyse zeigten die thermischen CD-Schmelzdaten, dass SPACA6 (Tm = 51,2 °C) weniger stabil ist als IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (Abb. S1e und S19).
a H-DXMS-Bilder von SPACA6 und b IZUMO1.Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde der prozentuale Deuteriumaustausch bestimmt.Der Grad des Wasserstoff-Deuterium-Austauschs wird durch die Farbe auf einer Farbverlaufsskala von Blau (10 %) bis Rot (90 %) angezeigt.Black Boxes stellen Bereiche mit hohem Austausch dar.Die in der Kristallstruktur beobachteten Grenzen von 4HB, Scharnier und Ig-ähnlicher Domäne sind oberhalb der Primärsequenz dargestellt.Die Deuteriumaustauschniveaus bei 10 s, 1000 s und 100.000 s wurden auf einem Streifendiagramm aufgezeichnet, das über die transparenten Moleküloberflächen von SPACA6 und IZUMO1 gelegt wurde.Teile von Strukturen mit einem Deuteriumaustauschgrad unter 50 % sind weiß eingefärbt.Bereiche über 50 % H-DXMS-Austausch werden in einer Farbverlaufsskala eingefärbt.
Der Einsatz von CRISPR/Cas9 und genetischen Gen-Knockout-Strategien bei Mäusen hat zur Identifizierung mehrerer Faktoren geführt, die für die Bindung und Fusion von Spermien und Eizellen wichtig sind.Abgesehen von der gut charakterisierten Wechselwirkung von IZUMO1-JUNO und der CD9-Struktur bleiben die meisten mit der Gametenfusion verbundenen Proteine ​​strukturell und funktionell rätselhaft.Die biophysikalische und strukturelle Charakterisierung von SPACA6 ist ein weiterer Teil des molekularen Adhäsions-/Fusionspuzzles während der Befruchtung.
SPACA6 und andere Mitglieder der IST-Superfamilie scheinen bei Säugetieren sowie einzelnen Vögeln, Reptilien und Amphibien hoch konserviert zu sein;Tatsächlich wird angenommen, dass SPACA6 sogar für die Befruchtung im Zebrafisch erforderlich ist 59. Diese Verteilung ähnelt anderen bekannten Gametenfusions-assoziierten Proteinen wie DCST134, DCST234, FIMP31 und SOF132, was darauf hindeutet, dass diese Faktoren HAP2-defizient sind (auch bekannt als GCS1)-Proteine, die für die katalytische Aktivität vieler Protisten verantwortlich sind., Pflanzen und Arthropoden.Befruchtete Fusionsproteine ​​60, 61. Trotz der starken strukturellen Ähnlichkeit zwischen SPACA6 und IZUMO1 führte der Ausfall von Genen, die für eines dieser Proteine ​​kodieren, bei männlichen Mäusen zu Unfruchtbarkeit, was darauf hindeutet, dass ihre Funktionen bei der Gametenfusion nicht dupliziert werden..Im weiteren Sinne ist keines der bekannten Spermienproteine, die für die Adhäsionsphase der Fusion erforderlich sind, überflüssig.
Es bleibt eine offene Frage, ob SPACA6 (und andere Mitglieder der IST-Superfamilie) an intergametischen Verbindungen beteiligt sind, intragametische Netzwerke bilden, um wichtige Proteine ​​an Fusionspunkten zu rekrutieren, oder vielleicht sogar als schwer fassbare Fusogene fungieren.Co-Immunpräzipitationsstudien in HEK293T-Zellen zeigten eine Wechselwirkung zwischen IZUMO1 voller Länge und SPACA632.Allerdings interagierten unsere rekombinanten Ektodomänen in vitro nicht, was darauf hindeutet, dass die bei Noda et al.wurden beide im Konstrukt gelöscht (beachten Sie den zytoplasmatischen Schwanz von IZUMO1, der sich nachweislich für die Befruchtung als unnötig erwiesen hat62).Alternativ erfordern IZUMO1 und/oder SPACA6 möglicherweise spezifische Bindungsumgebungen, die wir in vitro nicht reproduzieren, wie z. B. physiologisch spezifische Konformationen oder Molekülkomplexe, die andere Proteine ​​(bekannt oder noch nicht entdeckt) enthalten.Obwohl angenommen wird, dass die IZUMO1-Ektodomäne die Anheftung von Spermatozoen an die Eizelle im perivitellinen Raum vermittelt, ist der Zweck der SPACA6-Ektodomäne unklar.
Die Struktur von SPACA6 zeigt mehrere konservierte Oberflächen, die möglicherweise an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind.Der konservierte Teil der Gelenkregion unmittelbar neben dem CXXC-Motiv (oben als Patch 1 bezeichnet) weist mehrere nach außen gerichtete aromatische Reste auf, die häufig mit hydrophoben und π-Stapel-Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen verbunden sind.Die breiten Seiten der Ig-ähnlichen Domäne (Region 2) bilden eine positiv geladene Furche mit hochkonservierten Arg- und His-Resten, und Antikörper gegen diese Region wurden zuvor verwendet, um die Gametenfusion zu blockieren 30 .Der Antikörper erkennt das lineare Epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, das drei der sechs Argininreste und hochkonserviertes His220 aufweist.Es ist nicht klar, ob die Funktionsstörung auf eine Blockade dieser spezifischen Rückstände oder der gesamten Region zurückzuführen ist.Die Lage dieser Lücke in der Nähe des C-Terminus des β-Sandwichs weist auf cis-Wechselwirkungen mit benachbarten Spermienproteinen hin, nicht jedoch mit Oozytenproteinen.Darüber hinaus kann die Beibehaltung eines hochflexiblen prolinreichen Knäuels (Stelle 3) innerhalb des Gelenks der Ort einer Protein-Protein-Wechselwirkung sein oder, was wahrscheinlicher ist, auf die Beibehaltung der Flexibilität zwischen den beiden Domänen hinweisen.Das Geschlecht ist wichtig für die unbekannte Rolle von SPACA6.Verschmelzung von Gameten.
SPACA6 besitzt Eigenschaften interzellulärer Adhäsionsproteine, einschließlich Ig-ähnlicher β-Sandwiches.Viele adhäsive Proteine ​​(z. B. Cadherine, Integrine, Adhäsine und IZUMO1) besitzen eine oder mehrere β-Sandwich-Domänen, die Proteine ​​von der Zellmembran zu ihren Umweltzielen ausdehnen63,64,65.Die Ig-ähnliche Domäne von SPACA6 enthält auch ein Motiv, das häufig in β-Sandwiches der Adhäsion und Kohäsion vorkommt: Dubletts paralleler Stränge an den Enden von β-Sandwiches, bekannt als mechanische Klammern66.Es wird angenommen, dass dieses Motiv die Widerstandsfähigkeit gegenüber Scherkräften erhöht, was für Proteine, die an interzellulären Wechselwirkungen beteiligt sind, wertvoll ist.Trotz dieser Ähnlichkeit mit Adhäsinen gibt es derzeit jedoch keine Hinweise darauf, dass SPACA6 mit Eiweiß interagiert.Die SPACA6-Ektodomäne ist nicht in der Lage, an JUNO zu binden, und SPACA6-exprimierende HEK293T-Zellen interagieren, wie hier gezeigt, kaum mit Eizellen, denen Zona 32 fehlt.Wenn SPACA6 tatsächlich intergametische Bindungen aufbaut, erfordern diese Interaktionen möglicherweise posttranslationale Modifikationen oder eine Stabilisierung durch andere Spermienproteine.Zur Unterstützung der letztgenannten Hypothese binden IZUMO1-defiziente Spermien an Eizellen, was zeigt, dass andere Moleküle als IZUMO1 am Schritt der Gametenadhäsion beteiligt sind 27 .
Viele virale, zelluläre und entwicklungsbedingte Fusionsproteine ​​haben Eigenschaften, die ihre Funktion als Fusogene vorhersagen.Beispielsweise verfügen virale Fusionsglykoproteine ​​(Klassen I, II und III) über ein hydrophobes Fusionspeptid oder eine hydrophobe Schleife am Ende des Proteins, das in die Wirtsmembran eingeführt wird.Die Hydrophiliekarte von IZUMO143 und die Struktur (bestimmt und vorhergesagt) der IST-Superfamilie zeigten kein offensichtliches hydrophobes Fusionspeptid.Wenn also Proteine ​​​​in der IST-Superfamilie als Fusogene fungieren, tun sie dies auf eine Weise, die sich von anderen bekannten Beispielen unterscheidet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Funktionen der Mitglieder der IST-Superfamilie von Proteinen, die mit der Gametenfusion verbunden sind, ein verlockendes Rätsel bleiben.Unser charakterisiertes rekombinantes SPACA6-Molekül und seine aufgeklärte Struktur werden Einblicke in die Beziehungen zwischen diesen gemeinsamen Strukturen und ihre Rolle bei der Anheftung und Fusion von Gameten geben.
Die DNA-Sequenz, die der vorhergesagten menschlichen SPACA6-Ektodomäne entspricht (NCBI-Zugangsnummer NP_001303901.1; Reste 27–246), wurde für die Expression in Drosophila melanogaster S2-Zellen codonoptimiert und als Genfragment mit der für Kozak kodierenden Sequenz (Eurofins Genomics) synthetisiert., das BiP-Sekretionssignal und die entsprechenden 5'- und 3'-Enden für die ligationsunabhängige Klonierung dieses Gens in einen pMT-Expressionsvektor, der auf einem Metallothionein-Promotor basiert, der für die Selektion mit Puromycin (pMT-puro) modifiziert wurde.Der pMT-puro-Vektor kodiert für eine Thrombin-Spaltstelle, gefolgt von einem 10x-His-C-terminalen Tag (Abbildung S2).
Eine stabile Transfektion des SPACA6 pMT-puro-Vektors in D. melanogaster S2 (Gibco)-Zellen wurde ähnlich dem für IZUMO1 und JUNO43 verwendeten Protokoll durchgeführt.S2-Zellen wurden aufgetaut und in Schneider-Medium (Gibco), ergänzt mit einer Endkonzentration von 10 % (v/v) hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (Gibco) und 1X antimykotisches Antibiotikum (Gibco), gezüchtet.Zellen der frühen Passage (3,0 x 106 Zellen) wurden in einzelnen Vertiefungen von Platten mit 6 Vertiefungen (Corning) ausplattiert.Nach 24-stündiger Inkubation bei 27 °C wurden die Zellen mit einer Mischung aus 2 mg des SPACA6 pMT-puro-Vektors und Effectene-Transfektionsreagenz (Qiagen) gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert.Transfizierte Zellen wurden 72 Stunden lang inkubiert und dann mit 6 mg/ml Puromycin geerntet.Anschließend wurden die Zellen aus vollständigem Schneider-Medium isoliert und zur Proteinproduktion im großen Maßstab in serumfreies Insect-XPRESS-Medium (Lonza) gegeben.Eine 1-l-Charge S2-Zellkultur wurde in einem belüfteten 2-l-Flachboden-Erlenmeyerkolben aus Polypropylen auf 8–10 × 106 ml-1 Zellen gezüchtet und anschließend mit einer Endkonzentration von 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) sterilisiert und steril filtriert.induziert.Die induzierten Kulturen wurden vier Tage lang bei 27°C und 120 U/min inkubiert.
Konditioniertes Medium, das SPACA6 enthielt, wurde durch Zentrifugation bei 5660 × g und 4 °C isoliert, gefolgt von einem Centramate-Tangentialflussfiltrationssystem (Pall Corp) mit einer 10 kDa MWCO-Membran.Tragen Sie konzentriertes Medium mit SPACA6 auf eine 2 ml Ni-NTA-Agaroseharz-Säule (Qiagen) auf.Das Ni-NTA-Harz wurde mit 10 Säulenvolumina (CV) Puffer A gewaschen und dann wurde 1 CV Puffer A zugegeben, um eine Imidazol-Endkonzentration von 50 mM zu ergeben.SPACA6 wurde mit 10 ml Puffer A, ergänzt mit Imidazol, bis zu einer Endkonzentration von 500 mM eluiert.Thrombin der Restriktionsklasse (Millipore Sigma) wurde direkt in den Dialyseschlauch (MWCO 12–14 kDa) mit 1 Einheit pro mg SPACA6 vs. 1 l 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 150 mM NaCl (Puffer B) für die Dialyse gegeben.) bei 4°C für 48 Stunden.Das mit Thrombin gespaltene SPACA6 wurde dann dreifach verdünnt, um die Salzkonzentration zu reduzieren, und auf eine 1 ml MonoS 5/50 GL-Kationenaustauschersäule (Cytiva/GE) geladen, die mit 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, äquilibriert war.Der Kationenaustauscher wurde mit 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, gewaschen, dann wurde SPACA6 mit einem linearen Gradienten von 0 bis 500 mm NaCl in 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 für 25 OK eluiert.Nach der Ionenaustauschchromatographie wurde SPACA6 auf 1 ml konzentriert und isokratisch von einer mit Puffer B äquilibrierten ENrich SEC650 10 x 300-Säule (BioRad) eluiert. Gemäß dem Chromatogramm wurden SPACA6 enthaltende Fraktionen gesammelt und konzentriert.Die Reinheit wurde durch Coomassie-gefärbte Elektrophorese auf einem 16 % SDS-Polyacrylamidgel kontrolliert.Die Proteinkonzentration wurde durch Absorption bei 280 nm unter Verwendung des Lambert-Beerschen Gesetzes und des theoretischen molaren Extinktionskoeffizienten quantifiziert.
Gereinigtes SPACA6 wurde über Nacht gegen 10 mM Natriumphosphat, pH 7,4 und 150 mM NaF dialysiert und vor der Analyse mittels CD-Spektroskopie auf 0,16 mg/ml verdünnt.Die spektrale Abtastung von CDs mit einer Wellenlänge von 185 bis 260 nm wurde auf einem Spektropolarimeter Jasco J-1500 unter Verwendung von Quarzküvetten mit einer optischen Weglänge von 1 mm (Helma) bei 25 °C und einer Geschwindigkeit von 50 nm/min durchgeführt.Die CD-Spektren wurden grundlinienkorrigiert, über 10 Aufnahmen gemittelt und in die mittlere Restelliptizität (θMRE) in Grad cm2/dmol umgerechnet:
wobei MW das Molekulargewicht jeder Probe in Da ist;N ist die Anzahl der Aminosäuren;θ ist die Elliptizität in Milligrad;d entspricht der Länge des optischen Weges in cm;Proteinkonzentration in Einheiten.