347 12,7*1,24 mm Edelstahl-Spiralrohr, Molekularer Mechanismus der synchronen elektrostatischen Kondensation und Koaggregation von α-Synuclein und Tau

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Spezifikation für Edelstahlrohre 347

347 12,7*1,24 mm Spiralrohr aus Edelstahl

Außendurchmesser: 6,00 mm Außendurchmesser bis 914,4 mm Außendurchmesser, Größen bis 24 Zoll (NB) ab Lager verfügbar, Stahlrohre mit Außendurchmesser ab Lager verfügbar

SS 347 Rohrdickenbereich: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S usw. (0,5–12 mm) Oder nicht reguläre Größe, die je nach Bedarf angepasst werden kann

Typ: Nahtlose Rohre SS 347 |SS 347 ERW-Rohre |SS 347 geschweißte Rohre |SS 347 gefertigte Rohre |SS 347 CDW-Rohre, LSAW-Rohre / Nahtgeschweißt / Nachgezogen

Form: SS 347 runde Rohre/Röhren, SS 347 quadratische Rohre/Röhren, SS 347 rechteckige Rohre/Röhren, SS 347 Spiralrohre, SS 347 „U“-Form, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulikrohre

Länge: Einfach zufällig, Doppelt zufällig und gewünschte Länge. Ende: Glattes Ende, abgeschrägtes Ende, mit Profil

Endschutz: Kunststoffkappen |Außenfinish: 2B, Nr. 4, Nr. 1, Nr. 8 Spiegelfinish für Edelstahlrohre, Finish gemäß Kundenanforderungen

Lieferzustand: Geglüht und gebeizt, poliert, blankgeglüht, kaltgezogen

Inspektion, Testberichte: Werkstestzertifikate, EN 10204 3.1, chemische Berichte, mechanische Berichte, PMI-Testberichte, visuelle Inspektionsberichte, Inspektionsberichte Dritter, NABL-anerkannte Laborberichte, zerstörende Testberichte, zerstörungsfreie Testberichte

Verpackung: Verpackt in Holzkisten, Plastiktüten, gebündelten Stahlbändern oder nach Kundenwunsch

Besonderheiten: Andere Größen und Spezifikationen als oben können auf Anfrage gefertigt werden

SS 347-Rohrgrößenbereich: 1/2 Zoll NB, Außendurchmesser bis 24 Zoll

ASTM A312 347: Nahtlose und gerade nahtgeschweißte austenitische Rohre für den Einsatz bei hohen Temperaturen und allgemeiner Korrosion.Beim Schweißen ist kein Zusatzwerkstoff zulässig.

ASTM A358 347: Elektroschmelzgeschweißtes austenitisches Rohr für korrosiven und/oder Hochtemperaturbetrieb.Normalerweise werden nach dieser Spezifikation nur Rohre bis zu 8 Zoll hergestellt.Beim Schweißen ist die Zugabe von Zusatzwerkstoff zulässig.

ASTM A790 347: Nahtlose und gerade nahtgeschweißte ferritisch/austenitische (Duplex-)Rohre für allgemeine Korrosionsanwendungen mit besonderem Schwerpunkt auf der Beständigkeit gegen Spannungsrisskorrosion.

ASTM A409 347: Elektroschmelzgeschweißtes austenitisches Leichtwandrohr mit großem Durchmesser und gerader Naht oder Spiralnaht in den Größen 14 bis 30 Zoll mit Wänden Sch5S und Sch 10S für korrosive und/oder hohe Korrosion

ASTM A376 347: Nahtloses austenitisches Rohr für Hochtemperaturanwendungen.

ASTM A813 347: Einnaht-, einfach oder doppelt geschweißtes austenitisches Rohr für Hochtemperatur- und allgemeine Korrosionsanwendungen.

ASTM A814 347: Kaltverformtes, geschweißtes austenitisches Rohr für Hochtemperatur- und allgemeine Korrosionsanwendungen.

Chemische Zusammensetzung von 347H-Edelstahlrohren

Mechanische Eigenschaften von Rohren aus Edelstahl 347H

Physikalische Eigenschaften von Rohren aus Edelstahl 347H

Äquivalente Qualitäten für 347H-Edelstahlrohre

Die Aggregation von Amyloid-Alpha-Synuclein (αS) ist ein Kennzeichen der Parkinson-Krankheit und anderer Synukleinopathien.Kürzlich wurde das häufig mit der Alzheimer-Krankheit assoziierte Tau-Protein mit der αS-Pathologie in Verbindung gebracht und festgestellt, dass es sich in αS-reichen Einschlüssen kolokalisiert, obwohl der molekulare Mechanismus der Koaggregation der beiden Proteine ​​weiterhin unklar ist.Wir berichten hier, dass sich die αS-Phase durch elektrostatische Komplexkondensation mit positiv geladenen Polypeptiden wie Tau in flüssige Kondensate trennt.Abhängig von der Affinität von αS für Polykationen und der Geschwindigkeit der Valenzverarmung des Gerinnungsnetzwerks unterliegen Gerinnsel einer schnellen Gelierung oder Koaleszenz, gefolgt von einer langsamen Amyloidaggregation.Durch die Kombination einer Reihe fortschrittlicher biophysikalischer Techniken konnten wir die Flüssig-Flüssig-αS/Tau-Phasentrennung charakterisieren und die Schlüsselfaktoren identifizieren, die zur Bildung heterogener Aggregate führen, die beide Proteine ​​in einem flüssigen Proteinkondensat enthalten.
Neben Membrankompartimenten kann die räumliche Trennung in Zellen auch durch die Bildung proteinreicher, flüssigkeitsähnlicher dichter Körper, sogenannter biomolekularer Kondensate oder Tröpfchen, durch einen Prozess erreicht werden, der als Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) bekannt ist.Diese Tröpfchen entstehen durch multivalente zeitliche Wechselwirkungen, meist zwischen Proteinen oder Proteinen und RNA, und erfüllen in fast allen lebenden Systemen vielfältige Funktionen.Eine große Anzahl LLP-fähiger Proteine ​​weist Sequenzen geringer Komplexität auf, die in ihrer Natur und bei der Bildung biomolekularer Kondensate stark ungeordnet sind3,4,5.Zahlreiche experimentelle Studien haben die flexible, oft ungeordnete und multivalente Natur der Proteine ​​offenbart, aus denen diese flüssigkeitsähnlichen Kondensate bestehen. Allerdings ist wenig über die spezifischen molekularen Determinanten bekannt, die das Wachstum und die Reifung dieser Kondensate zu eher feststoffähnlichen Produkten steuern Zustand..
Die neuen Daten stützen die Hypothese, dass fehlerhafte proteingesteuerte LLPS und die Umwandlung von Tröpfchen in feste Strukturen relevante zelluläre Wege sein könnten, die zur Bildung unlöslicher toxischer Aggregate führen, die oft ein Kennzeichen degenerativer Erkrankungen sind.Viele LLPS-assoziierte intrinsisch ungeordnete Proteine ​​(IDPs), oft hoch geladen und flexibel, werden seit langem durch den Prozess der Amyloidaggregation mit Neurodegeneration in Verbindung gebracht.Insbesondere biomolekulare IDP-Kondensate wie FUS7 oder TDP-438 oder Proteine ​​mit großen Domänen geringer Komplexität wie hnRNPA19 altern nachweislich durch einen als Fluidisierung bezeichneten Prozess zu gelartigen oder sogar festen Formen.Verbindung.zum Festphasenübergang (LSPT) als Funktion der Zeit oder als Reaktion auf bestimmte posttranslationale Modifikationen oder pathologisch signifikante Mutationen1,7.
Ein weiteres mit LLPS in vivo assoziiertes IDP ist Tau, ein Mikrotubuli-assoziiertes gestörtes Protein, dessen Amyloidaggregation mit der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht wird10, aber kürzlich auch mit der Parkinson-Krankheit (PD) und anderen damit verbundenen synaptischen Kernproteinopathien in Zusammenhang gebracht wurde 11, 12, 13.Tau dissoziiert nachweislich aufgrund günstiger elektrostatischer Wechselwirkungen spontan aus der Lösung/dem Zytoplasma14, was zur Bildung von mit Tau angereicherten Tröpfchen führt, die als elektrostatische Koazervate bekannt sind.Es wurde auch beobachtet, dass diese Art unspezifischer Wechselwirkung die treibende Kraft hinter vielen biomolekularen Kondensaten in der Natur ist15.Im Fall eines Tau-Proteins kann die elektrostatische Aggregation durch einfache Aggregation entstehen, bei der entgegengesetzt geladene Bereiche des Proteins den Spaltungsprozess auslösen, oder durch komplexe Aggregation durch Wechselwirkung mit negativ geladenen Polymeren wie RNA.
Kürzlich wurde α-Synuclein (αS), ein Amyloid-IDP, das an der Parkinson-Krankheit und anderen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt ist, die zusammen als Synukleinopathie bezeichnet werden17,18, in Zell- und Tiermodellen19,20 in konzentrierter Form in Proteinkondensaten mit flüssigkeitsähnlichem Verhalten nachgewiesen.In-vitro-Studien haben gezeigt, dass αS durch einfache Aggregation durch überwiegend hydrophobe Wechselwirkungen LLPS durchläuft, obwohl dieser Prozess außergewöhnlich hohe Proteinkonzentrationen und atypisch lange Inkubationszeiten erfordert19,21.Ob die in vivo beobachteten αS-haltigen Kondensate durch diesen oder andere LLPS-Prozesse gebildet werden, bleibt eine zentrale ungelöste Frage.Auch wenn in Neuronen bei PD und anderen Synucleinopathien eine αS-Amyloidaggregation beobachtet wurde, bleibt der genaue Mechanismus, durch den αS eine intrazelluläre Amyloidaggregation durchläuft, unklar, da die Überexpression dieses Proteins diesen Prozess offenbar nicht selbst auslöst.Häufig sind zusätzliche zelluläre Schäden erforderlich, was darauf hindeutet, dass bestimmte zelluläre Standorte oder Mikroumgebungen für die Renukleierung intrazellulärer αS-Amyloid-Anordnungen erforderlich sind.Eine zelluläre Umgebung, die besonders anfällig für Aggregation ist, könnte das Innere von Proteinkondensaten sein 23 .
Interessanterweise wurde festgestellt, dass sich αS und Tau in charakteristischen Krankheitseinschlüssen bei Menschen mit Parkinson-Krankheit und anderen Synukleinopathien kolokalisieren 24,25 und Experimente haben eine synergistische pathologische Beziehung zwischen den beiden Proteinen berichtet 26,27, was auf eine mögliche Beziehung zwischen der Aggregation von αS und schließen lässt Tau bei neurodegenerativen Erkrankungen.Erkrankung.Es wurde festgestellt, dass αS und Tau in vitro und in vivo interagieren und die gegenseitige Aggregation fördern 28,29 und heterogene Aggregate aus diesen beiden Proteinen wurden im Gehirn von Patienten mit Synukleinopathien beobachtet 30 .Über die molekulare Grundlage der Wechselwirkung zwischen αS und Tau und den Mechanismus seiner Co-Aggregation ist jedoch wenig bekannt.Es wurde berichtet, dass αS mit Tau durch eine elektrostatische Anziehung zwischen der stark negativ geladenen C-terminalen Region von αS und der zentralen prolinreichen Region von Tau interagiert, die ebenfalls an positiv geladenen Resten angereichert ist.
In dieser Studie zeigen wir, dass αS im Gegensatz zu seiner Wechselwirkung mit anderen positiv geladenen Polypeptiden wie Poly-L-Lysin (pLK) tatsächlich durch elektrostatische Komplexkondensation in Gegenwart von Tau-Protein in Tröpfchen dissoziieren kann.αS fungiert als Gerüstmolekül für das Tröpfchennetzwerk.Wir haben deutliche Unterschiede im Reifungsprozess elektrostatischer αS-Koazervate festgestellt, die mit Unterschieden in der Wertigkeit und Stärke der Wechselwirkung der am Koazervatnetzwerk beteiligten Proteine ​​verbunden sind.Interessanterweise beobachteten wir die Co-Aggregation von αS- und Tau-Amyloid-Proteinen in langlebigen flüssigen Koazervaten und identifizierten einige Schlüsselfaktoren, die zur Co-Aggregation dieser beiden Proteine ​​in solchen Koazervaten führen.Hier beschreiben wir detailliert diesen Prozess, der ein möglicher molekularer Mechanismus ist, der der Kolokalisierung zweier Proteine ​​in krankheitsspezifischen Einschlüssen zugrunde liegt.
αS hat bei neutralem pH-Wert einen stark anionischen C-terminalen Schwanz (Abb. 1a), und wir stellten die Hypothese auf, dass es durch Kondensation elektrostatischer Komplexe mit polykationisch ungeordneten Polypeptidmolekülen eine LLPS eingehen könnte.Aufgrund seiner positiv geladenen und ungeordneten Polymernatur bei neutralem pH-Wert 32 verwendeten wir ein Poly-L-Lysin (pLK) mit 100 Resten als Ausgangsmodellmolekül. Zunächst bestätigten wir mittels Lösungs-NMR-Spektroskopie, dass pLK mit der Ct-Domäne von αS interagiert (Abbildung 1b) unter Verwendung von 13C/15N-markiertem αS in Gegenwart steigender molarer Verhältnisse von αS:pLK.Die Wechselwirkung von pLK mit der Ct-Domäne von αS äußert sich in Störungen der chemischen Verschiebung und einer Abnahme der Peakintensität in dieser Region des Proteins.Interessanterweise mischten wir αS mit pLK bei einer αS-Konzentration von ca.5–25 µM in Gegenwart von Polyethylenglykol (5–15 % PEG-8) (typischer LLPS-Puffer: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15 % PEG-8) durchliefen wir sofort ein weites Feld der Proteinbildung .Tröpfchen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie (WF) und Hellfeldmikroskopie (BF) beobachtet (Abb. 1c).1–5 µm große Tröpfchen, die konzentriertes αS enthalten (zugegeben 1 µM AlexaFluor488-markiertes αS, AF488-αS). Ihre elektrostatischen Eigenschaften können aus ihrer Beständigkeit gegenüber 10 % 1,6-Hexandiol (1,6-HD) und ihrer Empfindlichkeit gegenüber abgeleitet werden ein Anstieg der NaCl-Konzentration (Abb. 1c).Die flüssigkeitsähnliche Natur der Koazervate des elektrostatischen Komplexes αS/pLK wird durch ihre Fähigkeit, innerhalb von Millisekunden zu fusionieren, belegt (Abb. 1d).Mithilfe der Turbidimetrie haben wir die Bildung von Tröpfchen unter diesen Bedingungen quantifiziert, die elektrostatische Natur der mit ihrer Stabilität verbundenen Hauptwechselwirkung bestätigt (Abb. 1e) und die Auswirkung verschiedener Polymerverhältnisse auf den LLPS-Prozess bewertet (Abb. 1f).Obwohl die Tröpfchenbildung über einen weiten Bereich von Polymerverhältnissen beobachtet wird, ist der Prozess sehr günstig, wenn pLK größer als αS ist.LLPs wurden auch bei Verwendung des chemisch unterschiedlichen Verdrängungsmittels Dextran-70 (70 kDa) oder bei Verwendung verschiedener Probenformate beobachtet, darunter Glasobjektträgertropfen, Mikrotiterplattenvertiefungen aus verschiedenen Materialien, Eppendorf- oder Quarzkapillaren.
a Schematische Darstellung verschiedener Proteinregionen in den in dieser Studie verwendeten WT-αS- und ΔCt-αS-Varianten.Die amphipathische N-terminale Domäne, die hydrophobe amyloidbildende (NAC) Region und die negativ geladene C-terminale Domäne sind jeweils in Blau, Orange und Rot dargestellt.Die NCPR-Karte (Net Charge Per Residual) von WT-αS wird angezeigt.b NMR-Analyse der αS/pLK-Wechselwirkung in Abwesenheit makromolekularer Klumpen.Mit zunehmender pLK-Konzentration (αS:pLK-Molverhältnisse von 1:0,5, 1:1,5 und 1:10 werden in hellgrün, grün bzw. dunkelgrün angezeigt).c Koazervatisieren Sie αS/pLK (molares Verhältnis 1:10) bei 25 µM (1 µM AF488-markiertes αS oder Atto647N-markiertes pLK für WF-Bildgebung) in LLPS-Puffer (oben) oder ergänzt mit 500 mM NaCl (unten links) oder nach 10 % 1,6-Hexandiol (1,6-HD; unten rechts).Maßstabsbalken = 20 µm.d Repräsentative mikroskopische Bilder der BF-Tröpfchenfusion von αS/pLK (molares Verhältnis 1:10) bei einer Konzentration von 25 μM;Pfeile zeigen die Verschmelzung einzelner Tropfen (rote und gelbe Pfeile) zu einem neuen Tropfen (orangefarbener Pfeil) innerhalb von 200 ms an.Maßstabsbalken = 20 µm.e Lichtstreuung (bei 350 nm) αS/pLK-Aggregation in LLPS-Puffer vor und nach Zugabe von 500 mM NaCl oder 10 % 1,6-HD bei 25 µM αS (N = 3 Probenreplikationen, Mittelwert und Standardabweichung ebenfalls angegeben).f BF-Bild (oben) und Lichtstreuungsanalyse (bei 350 nm, unten) der αS/pLK-Aggregation bei 25 μM αS mit steigendem molaren Verhältnis αS:pLK (N = 3 Probenreplikationen, Mittelwert und Standardabweichung ebenfalls angegeben).Maßstabsbalken = 10 µm.Der Maßstabsbalken auf einem Bild zeigt den Maßstab aller Bilder in einem Panel an.Rohdaten werden in Form von Rohdatendateien bereitgestellt.
Basierend auf unseren Beobachtungen der elektrostatischen Komplexkondensation von αS/pLK und früheren Beobachtungen von αS als Clientmolekül des Tau/RNA-Kondensats durch direkte Wechselwirkung mit Tau31 stellten wir die Hypothese auf, dass sich αS und Tau in Abwesenheit von RNA gemeinsam mit dem Lösungsmittel trennen könnten Kondensation.durch elektrostatische Komplexe, und αS ist das Gerüstprotein in αS/Tau-Koazervaten (siehe Tau-Ladungsverteilung in Abbildung 2e).Wir beobachteten, dass sich beim Mischen von 10 μM αS und 10 μM Tau441 (enthaltend 1 μM AF488-αS bzw. 1 μM Atto647N-Tau) in LLPS-Puffer leicht Proteinaggregate bildeten, die beide Proteine ​​enthielten, wie durch WF-Mikroskopie zu sehen war.(Abb. 2a).Die Kolokalisierung der beiden Proteine ​​in den Tröpfchen wurde durch konfokale (CF) Mikroskopie bestätigt (ergänzende Abbildung 1a).Ein ähnliches Verhalten wurde beobachtet, wenn Dextran-70 als Aggregationsmittel verwendet wurde (ergänzende Abbildung 1c).Unter Verwendung von FITC-markiertem PEG oder Dextran stellten wir fest, dass beide Crowding-Mittel gleichmäßig über die Proben verteilt waren und weder eine Segregation noch eine Assoziation zeigten (ergänzende Abbildung 1d).Vielmehr deutet es darauf hin, dass sie in diesem System die Phasentrennung durch makromolekulare Crowding-Effekte fördern, da PEG ein bevorzugt stabiles Crowding-Mittel ist, wie es in anderen LLP-Systemen zu beobachten ist33,34.Diese proteinreichen Tröpfchen reagierten empfindlich auf NaCl (1 M), jedoch nicht auf 1,6-HD (10 % v/v), was ihre elektrostatischen Eigenschaften bestätigte (ergänzende Abbildung 2a, b).Ihr Flüssigkeitsverhalten wurde durch Beobachtung von Millisekunden-Verschmelzungsereignissen von Tröpfchen mithilfe der BF-Mikroskopie bestätigt (Abb. 2b).
a Konfokale (CF) Mikroskopiebilder von αS/Tau441-Koazervaten in LLPS-Puffer (10 μM jedes Proteins, 0,5 μM AF488-markiertes αS und Atto647N-markiertes Tau441).b Repräsentative Differentialinterferenzkontrastbilder (DIC) von αS/Tau441-Tröpfchenfusionsereignissen (10 μM für jedes Protein).c Phasendiagramm basierend auf der Lichtstreuung (bei 350 nm) von Tau441 LLPS (0–15 µM) in Abwesenheit (links) oder Anwesenheit (rechts) von 50 µM αS.Wärmere Farben weisen auf eine stärkere Streuung hin.d Lichtstreuung von αS/Tau441-LLPS-Proben mit zunehmender αS-Konzentration (Tau441 bei 5 µM, N = 2–3 Probenwiederholungen wie angegeben).e Schematische Darstellung einiger Tau-Proteinvarianten und verschiedener Regionen des in dieser Studie verwendeten Proteins: negativ geladene N-terminale Domäne (rot), prolinreiche Region (blau), Mikrotubuli-bindende Domäne (MTBD, orange hervorgehoben) und amyloidbildende Paarspirale.Filamentregionen (PHF) innerhalb der MTBD (grau).Die NCPR-Karte (Net Charge Per Residue) von Tau441 wird angezeigt.f Verwendung von 1 µM AF488-markiertem αS und Atto647N-markiertem ΔNt-, Verwendung von 1 µM AF488-markiertem αS oder ΔCt-αS in Gegenwart von ΔNt-Tau (oben, 10 µM pro Protein) oder K18 (unten, 50 µM pro Protein). ) ) ) Mikroaufnahmen von WF, kondensiert in LLPS- oder K18-Puffer.Die Maßstabsbalken in einem Bild stellen den Maßstab aller Bilder in einem Panel dar (20 µm für Panel a, b und f).Rohdaten für Panel c und d werden als Rohdatendateien bereitgestellt.
Um die Rolle von αS in diesem LLPS-Prozess zu testen, untersuchten wir zunächst die Wirkung von αS auf die Tröpfchenstabilität durch Nephelometrie unter Verwendung steigender NaCl-Konzentrationen (Abb. 2c).Je höher die Salzkonzentration in den Proben, die αS enthalten, desto höher sind die Lichtstreuungswerte (bei 350 nm), was auf die stabilisierende Rolle von αS in diesem LLPS-System hinweist.Ein ähnlicher Effekt lässt sich beobachten, wenn man die αS-Konzentration (und damit das αS:Tau441-Verhältnis) auf ca. erhöht.10-facher Anstieg relativ zur Tau-Konzentration (5 µM) (Abb. 2d).Um zu zeigen, dass αS ein Gerüstprotein in Koazervaten ist, haben wir beschlossen, das Verhalten der LLPS-gestörten Tau-Mutante zu untersuchen, der eine negativ geladene N-terminale Region (Reste 1–150, siehe Abb. 2e) namens ΔNt-Tau fehlt.WF-Mikroskopie und Nephelometrie bestätigten, dass ΔNt-Tau selbst keine LLPS durchlief (Abb. 2f und ergänzende Abb. 2d), wie zuvor berichtet 14. Wenn jedoch αS zu Dispersionslösungen dieser verkürzten Tau-Variante hinzugefügt wurde, war der LLPS-Prozess vollständig unter ähnlichen Bedingungen und Proteinkonzentrationen mit einer Tröpfchendichte wiederhergestellt, die nahe an der Tröpfchendichte von Tau- und αS-Lösungen in Originalgröße liegt.Dieser Prozess kann auch unter Bedingungen geringer makromolekularer Überfüllung beobachtet werden (ergänzende Abbildung 2c).Die Rolle der C-terminalen αS-Region, jedoch nicht ihrer gesamten Länge, im LLPS-Prozess wurde durch Hemmung der Tröpfchenbildung unter Verwendung einer C-terminal verkürzten αS-Variante gezeigt, der die Reste 104–140 (Abb. 1a) des (ΔCt-) fehlen. αS)-Protein (Abb. 2f und ergänzende Abb. 2d).Die Kolokalisierung von αS und ΔNt-Tau wurde durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie bestätigt (ergänzende Abbildung 1b).
Um den LLPS-Mechanismus zwischen Tau441 und αS weiter zu testen, wurde eine zusätzliche Tau-Variante verwendet, nämlich das gepaarte helikale Filamentkernfragment (PHF) in der Mikrotubuli-Bindungsdomäne (MTBD), das, wenn es vier charakteristische Wiederholungsdomänen enthält, allgemein auch bekannt ist als K18-Fragment (siehe Abb. 2e).Kürzlich wurde berichtet, dass αS bevorzugt an ein Tau-Protein bindet, das sich in einer prolinreichen Domäne in einer Sequenz befindet, die der Mikrotubuli-Bindungsdomäne vorausgeht.Allerdings ist die PHF-Region auch reich an positiv geladenen Resten (siehe Abbildung 2e), insbesondere Lysin (15 % Reste), was uns dazu veranlasste zu testen, ob diese Region auch zur Kondensation des αS/Tau-Komplexes beiträgt.Wir beobachteten, dass K18 allein unter den getesteten Bedingungen (LLPS-Puffer mit 15 % PEG oder 20 % Dextran) bei Konzentrationen bis zu 100 μM kein LLPS auslösen konnte (Abbildung 2f).Als wir jedoch 50 µM αS zu 50 µM K18 hinzufügten, wurde durch Nephelometrie (ergänzende Abbildung 2d) und WF-Mikroskopie (Abb. 2f) eine schnelle Bildung von Proteintröpfchen beobachtet, die K18 und αS enthielten.Wie erwartet konnte ΔCt-αS das LLPS-Verhalten von K18 nicht wiederherstellen (Abb. 2f).Wir stellen fest, dass die αS/K18-Aggregation bei sonst gleichen Bedingungen etwas höhere Proteinkonzentrationen erfordert, um LLPS zu induzieren, als bei αS/ΔNt-Tau oder αS/Tau441.Dies steht im Einklang mit einer stärkeren Wechselwirkung der C-terminalen Region von αS mit der prolinreichen Tau-Domäne im Vergleich zur Mikrotubuli-bindenden Domäne, wie zuvor beschrieben 31 .
Da ΔNt-Tau in Abwesenheit von αS keine LLPS durchführen kann, haben wir diese Tau-Variante als Modell zur Charakterisierung von αS/Tau-LLPS gewählt, da sie in LLPS-Systemen mit Tau voller Länge (Isotyp, Tau441/Tau441) einfach ist.mit komplexen (heterotypischen, αS/Tau441) Aggregationsprozessen.Wir verglichen den Grad der αS-Aggregation (als Teil des kondensierten Phasenproteins, fαS,c) in den Systemen αS/Tau und αS/ΔNt-Tau durch Zentrifugation und SDS-PAGE-Analyse in dispergierter Phase (siehe 2e) und fanden sehr ähnliche Werte ​​für alle Proteine ​​in der gleichen Konzentration.Insbesondere erhielten wir fαS,c 84 ± 2 % und 79 ± 7 % für αS/Tau bzw. αS/ΔNt-Tau, was darauf hindeutet, dass die heterotypische Wechselwirkung zwischen αS und Tau der Wechselwirkung zwischen Tau-Molekülen überlegen ist.zwischen.
Die Wechselwirkung mit verschiedenen Polykationen und die Auswirkung des Kondensationsprozesses auf die αS-Kinetik wurden zunächst mit der Methode der Fluoreszenzwiederherstellung nach Photobleichung (FRAP) untersucht.Wir haben αS/Tau441-, αS/ΔNt-Tau- und αS/pLK-Koazervate getestet (100 μM αS ergänzt mit 2 μM αS AF488-αS und 100 μM Tau441 oder ΔNt-Tau oder 1 mM pLK).Die Daten wurden innerhalb der ersten 30 Minuten nach dem Mischen der Probenkomponenten erhoben.Aus repräsentativen FRAP-Bildern (Abb. 3a, αS/Tau441-Kondensation) und ihren entsprechenden Zeitverlaufskurven (Abb. 3b, ergänzende Abb. 3) ist ersichtlich, dass die αS-Kinetik denen von Tau441-Koazervaten sehr ähnlich ist.und ΔNt-Tau, was mit pLK viel schneller ist.Die berechneten Diffusionskoeffizienten für αS innerhalb des Koazervats gemäß FRAP (wie von Kang et al. 35 beschrieben) betragen D = 0,013 ± 0,009 µm2/s und D = 0,026 ± 0,008 µm2/s für αS/Tau441 und αS/ΔNt- für das αS/-System.pLK, Tau und D = 0,18 ± 0,04 µm2/s (Abb. 3c).Allerdings ist der Diffusionskoeffizient αS in der dispergierten Phase um mehrere Größenordnungen höher als in allen kondensierten Phasen, wie durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS, siehe ergänzende Abbildung 3) unter den gleichen Bedingungen (LLPS-Puffer), jedoch in Abwesenheit von Polykationen, bestimmt wurde (D = 8 ± 4 µm2/s).Daher ist die Kinetik der αS-Translation in Koazervaten im Vergleich zu Proteinen in der dispergierten Phase aufgrund ausgeprägter molekularer Crowding-Effekte deutlich verringert, obwohl alle Koazervate im Gegensatz zur Tau-Phase in der ersten halben Stunde nach ihrer Bildung flüssigkeitsähnliche Eigenschaften behalten.schnellere Kinetik im pLK-Kondensat.
a–c FRAP-Analyse der αS-Dynamik (2 % AF488-markiertes αS) in elektrostatischen Koazervaten.Repräsentative Bilder von αS/Tau441 FRAP-Assays in dreifacher Ausfertigung sind in (a) dargestellt, wobei rote Kreise entfärbte Bereiche anzeigen.Der Maßstabsbalken beträgt 5 µm.b Durchschnittliche FRAP-Kurven und (c) berechnete Diffusionskoeffizienten (D) für 5–6 (N) verschiedene Tröpfchen aus drei Experimenten mit 100 µM αS und äquimolaren Konzentrationen von Tau441 (rot) oder ΔNt-Tau (blau) oder pLK (grün). bei der zehnfachen Konzentration von LLPS.Die Standardabweichung der FRAP-Kurve wird in schattierter Farbe dargestellt.Zum Vergleich wurde der Diffusionskoeffizient αS in der dispergierten Phase dreifach mithilfe der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) bestimmt (weitere Informationen finden Sie in der ergänzenden Abbildung 3 und den Methoden).d Kontinuierliche X-Band-EPR-Spektren von 100 μM TEMPOL-122-αS in LLPS-Puffer ohne Polykation (schwarz) oder in Gegenwart von 100 μM Tau441 (rot) oder ΔNt-Tau (blau) oder 1 mM pLK (grün).Der Einschub zeigt eine vergrößerte Ansicht der starken Feldlinien, an denen die dramatischsten Veränderungen auftreten.e Bindungskurven von 50 μM TEMPOL-122-αS mit verschiedenen Polykationen in Abwesenheit von LLPS (kein PEG).Es zeigt sich, dass die verringerte Amplitude von Band III im Vergleich zu Band II (IIII/III) des normalisierten EPR-Spektrums die Molverhältnisse von Tau441 (rot), ΔNt-Tau (blau) und pLK (grün) erhöht.Farbige Linien zeigen die Anpassung an die Daten unter Verwendung eines groben Bindungsmodells mit n identischen und unabhängigen Bindungsstellen auf jeder Kurve.Rohdaten werden in Form von Rohdatendateien bereitgestellt.
Ergänzend untersuchten wir die Dynamik von αS in verschiedenen Koazervaten mittels gerichteter Spinmarkierung (SDSL) und kontinuierlicher paramagnetischer Elektronenresonanz (CW-EPR).Diese Methode hat sich als sehr nützlich erwiesen, um die Flexibilität und Dynamik des IDP mit einer realistischen Restauflösung zu melden36,37,38.Zu diesem Zweck konstruierten wir Cysteinreste in einzelnen Cys-Mutanten und verwendeten die Spinsonde 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL).Maleimid-Derivate kennzeichnen sie.Genauer gesagt haben wir TEMPOL-Sonden an Position 122 oder 24 αS eingefügt (TEMPOL-122-αS und TEMPOL-24-αS).Im ersten Fall zielen wir auf die C-terminale Region des Proteins, die an der Interaktion mit Polykationen beteiligt ist.Stattdessen kann uns Position 24 Aufschluss über die Gesamtdynamik der Proteine ​​im Kondensat geben.In beiden Fällen entsprachen die für Proteine ​​der dispersen Phase erhaltenen EPR-Signale den Nitroxidradikalen im sich schnell bewegenden Zustand.Nach Phasentrennung in Gegenwart von Tau oder pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 oder ΔNt-Tau im Verhältnis 1:1 oder pLK im Verhältnis 1:10) wurde ein Anstieg der relativen Peakintensität beobachtet das EPR-Spektrum von αS.Die Verlustlinie verbreiterte sich, was auf eine verringerte Kinetik der αS-Neuorientierung in Tröpfchen im Vergleich zu Protein in der verdünnten Phase hinweist (Abb. 3d, ergänzende Abb. 4a).Diese Änderungen sind an Position 122 ausgeprägter. Während an Position 24 das Vorhandensein von pLK keinen Einfluss auf die Kinetik der Sonde hatte, änderte sich an Position 122 die Spektrallinienform erheblich (ergänzende Abbildung 4a).Als wir versuchten, die Spektren an Position 122 von zwei αS/Polykation-Systemen mithilfe des isotropen Modells (ergänzende Abbildung 5a) zu modellieren, das üblicherweise zur Beschreibung der Dynamik von spinmarkiertem IDP38,39 verwendet wird, konnten wir die experimentellen Spektren nicht rekonstruieren..Spektrale Simulation der Position von 24 Spinkontrasten (ergänzende Abbildung 5a).Dies legt nahe, dass es in Gegenwart von Polykationen bevorzugte Positionen im Raum der Spinkonfigurationen der C-terminalen Region von αS gibt.Betrachtet man den Anteil von αS in der kondensierten Phase unter experimentellen EPR-Bedingungen (84 ± 2 %, 79 ± 7 % und 47 ± 4 % für αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau bzw. αS/pLK – siehe Ergänzung). Aus Abb. 2e der Datenanalyse c) ist ersichtlich, dass die mit der EPR-Methode festgestellte Verbreiterung hauptsächlich die Wechselwirkung der C-terminalen Region von αS mit verschiedenen Polykationen in der kondensierten Phase widerspiegelt (die Hauptänderung bei Verwendung von TEMPOL-122). αS) und nicht Proteinkondensation.In der Sonde wird ein Anstieg der Mikroviskosität beobachtet.Wie erwartet wurde das EPR-Spektrum des Proteins unter anderen Bedingungen als LLPS vollständig wiederhergestellt, als der Mischung 1 M NaCl zugesetzt wurde (ergänzende Abbildung 4b).Insgesamt legen unsere Daten nahe, dass die durch CW-EPR festgestellten Veränderungen hauptsächlich die Wechselwirkung der C-terminalen Region von αS mit verschiedenen Polykationen in der kondensierten Phase widerspiegeln, und diese Wechselwirkung scheint bei pLK stärker zu sein als bei Tau.
Um mehr Strukturinformationen über die Proteine ​​im Koazervat zu erhalten, haben wir uns entschieden, das LLPS-System mittels NMR in Lösung zu untersuchen.Wir konnten jedoch nur den in der dispergierten Phase verbliebenen αS-Anteil nachweisen, was möglicherweise auf eine verringerte Proteindynamik innerhalb des Koazervats und eine dichte Phase am Boden der Lösung in der NMR-Analyse zurückzuführen ist.Als wir die Struktur und Dynamik des in der dispergierten Phase der LLPS-Probe verbleibenden Proteins mittels NMR analysierten (ergänzende Abbildung 5c, d), stellten wir fest, dass sich das Protein in Gegenwart von pLK und ΔNt-Tau nahezu identisch verhielt die in der Sekundärstruktur und Dynamik des Proteinrückgrats lagen, was durch Experimente zur sekundären chemischen Verschiebung und R1ρ-Relaxation aufgedeckt wurde.NMR-Daten zeigen, dass der C-Terminus von αS aufgrund seiner Wechselwirkungen mit Polykationen einen erheblichen Verlust an Konformationsflexibilität erleidet, während er wie der Rest der Proteinsequenz seine ungeordnete Natur behält.
Da die in der kondensierten Phase von TEMPOL-122-αS beobachtete CW-EPR-Signalverbreiterung die Wechselwirkung des Proteins mit Polykationen widerspiegelt, führten wir eine EPR-Titration durch, um die Bindungsaffinität von αS an verschiedene Polykationen in Abwesenheit von LLPS (keine Akkumulation von) zu bewerten Puffer-LLPS), was darauf hindeutet, dass die Wechselwirkungen in verdünnten und konzentrierten Phasen gleich sind (was durch unsere Daten bestätigt wird, ergänzende Abbildung 4a und ergänzende Abbildung 6).Ziel war es herauszufinden, ob alle Koazervate trotz ihrer gemeinsamen flüssigkeitsähnlichen Eigenschaften ein zugrunde liegendes unterschiedliches Verhalten auf molekularer Ebene aufweisen.Wie erwartet verbreiterte sich das EPR-Spektrum mit zunehmender Polykationenkonzentration, was eine Abnahme der molekularen Flexibilität aufgrund molekularer Wechselwirkungen aller Wechselwirkungspartner nahezu bis zur Sättigung widerspiegelt (Abb. 3e, ergänzende Abb. 6).pLK erreichte diese Sättigung bei einem niedrigeren Molverhältnis (Polykation:αS) im Vergleich zu ΔNt-Tau und Tau441.Tatsächlich zeigte ein Vergleich der Daten mit einem ungefähren Bindungsmodell unter der Annahme von n identischen und unabhängigen Bindungsstellen, dass die scheinbare Dissoziationskonstante von pLK (~5 μM) eine Größenordnung niedriger ist als die von Tau441 oder ΔNt-Tau (~50 μM). ).µM).Obwohl dies eine grobe Schätzung ist, deutet dies darauf hin, dass αS eine höhere Affinität zu einfacheren Polykationen mit kontinuierlich positiven Ladungsbereichen aufweist.Angesichts dieses Affinitätsunterschieds zwischen αS und verschiedenen Polykationen stellten wir die Hypothese auf, dass sich ihre Flüssigkeitseigenschaften im Laufe der Zeit unterschiedlich ändern und daher unter unterschiedlichen LSPT-Prozessen leiden könnten.
Angesichts der stark überfüllten Umgebung innerhalb des Proteinkoazervats und der Amyloidnatur des Proteins haben wir das Verhalten des Koazervats über die Zeit beobachtet, um mögliche LSPT-Prozesse zu erkennen.Mithilfe der BF- und CF-Mikroskopie (Abbildung 4) beobachteten wir, dass αS/Tau441 in Lösung zu einem großen Teil koazerviert und große Tröpfchen bildet, die wie erwartet die Oberfläche am Boden der Vertiefung/des Objektträgers als vollständige Tröpfchen berühren und benetzen (ergänzende Abbildung). . 7d);Wir nennen diese bodengeformten Strukturen „Proteinflöße“.Diese Strukturen blieben flüssig, da sie die Fähigkeit zur Fusion beibehielten (ergänzende Abbildung 7b) und waren mehrere Stunden lang sichtbar, nachdem LLPS ausgelöst wurde (Abb. 4 und ergänzende Abbildung 7c).Wir haben beobachtet, dass der Benetzungsprozess auf der Oberfläche hydrophiler statt hydrophober Materialien begünstigt ist (ergänzende Abbildung 7a), wie es für elektrostatische Koazervate mit unausgeglichenen Ladungen und damit hohen elektrostatischen Oberflächenpotentialen erwartet wird.Bemerkenswerterweise wurden die Koaleszenz und das Rafting von αS/ΔNt-Tau deutlich reduziert, während αS/pLK-Kondensate deutlich reduziert wurden (Abb. 4).Während der kurzen Inkubationszeit konnten die αS/pLK-Tröpfchen koaleszieren und die hydrophile Oberfläche benetzen, dieser Prozess stoppte jedoch schnell und nach 5 Stunden Inkubation wurden nur begrenzte Koaleszenzereignisse und keine Benetzung beobachtet.– Gel-Tropf-Übergang.
Repräsentative BF (Graustufentafeln) und CF (rechte Tafeln, AF488-markiertes αS in Grün) von Koazervatproben mit 100 µM αS (1 % Fluoreszenzmarkierung) in LLPS-Puffer in Gegenwart von 100 µM Tau441 (oben) Fluoreszenz) mikroskopische Bilder ΔNt -Tau (Mitte) oder 1 mM pLK (unten) bei unterschiedlichen Inkubationszeiten und Fokushöhen (z, Abstand vom Boden der Plattenvertiefung).Die Experimente wurden unabhängig voneinander 4–6 Mal mit den gleichen Ergebnissen wiederholt.αS/Tau441-Koazervate werden nach 24 Stunden benetzt und bilden Flöße, die größer als das Bild sind.Der Maßstabsbalken für alle Bilder beträgt 20 µm.
Wir fragten dann, ob die großen flüssigkeitsähnlichen Proteinpools, die in αS/Tau441-LLPS gebildet werden, zur Amyloidaggregation eines der untersuchten Proteine ​​führen würden.Wir verfolgten die Reifung von αS/Tau441-Tröpfchen über die Zeit mit WF-Mikroskopie unter den gleichen Bedingungen wie oben, verwendeten jedoch 1 μM AF488-markiertes αS und Atto647N-markiertes Tau441 (Abb. 5a).Wie erwartet beobachteten wir während des gesamten Reifungsprozesses eine vollständige Proteinlokalisierung.Interessanterweise ab ca.Nach 5 Stunden wurden im Inneren der Flöße intensivere nicht-kreisförmige Strukturen beobachtet, die wir „Punkte“ nannten, von denen einige mit αS kolokalisiert und andere mit Tau441 angereichert waren (Abb. 5a, weiße Pfeile).Diese Flecken wurden innerhalb von Flößen schon immer in größerem Ausmaß für αS/ΔNt-Tau beobachtet als für αS/ΔNt-Tau.Es gab keine deutlichen Flecken in den Tröpfchen der pLK- und Tau-Systeme, die für Fusion/Benetzung inkompetent waren.Um zu testen, ob es sich bei diesen Flecken, die αS und Tau441 enthalten, um amyloidähnliche Aggregate handelt, führten wir ein ähnliches Experiment mit CF-Mikroskopie durch, bei dem Tau441 mit Atto647N markiert wurde und von Anfang an 12,5 μM amyloidspezifisches Thioflavin-T (ThT) hinzugefügt wurden.Farbstoff.Obwohl selbst nach 24-stündiger Inkubation keine ThT-Färbung von αS/Tau441-Tröpfchen oder -Flößen beobachtet wurde (Abb. 5b, obere Reihe – verbleibende Tröpfchen über Protein-Flößen), waren ThT-positive Strukturen, die Atto647N-Tau441 in den Flößen enthielten, sehr schwach.Dies spiegelt die Größe, Form und Lage der zuvor beschriebenen Flecken wider (Abb. 5b, mittlere und untere Reihe), was darauf hindeutet, dass die Flecken amyloidähnlichen Aggregaten entsprechen könnten, die in alternden Flüssigkeitskoazervaten gebildet werden.
WF 25 μM αS bei verschiedenen Inkubationszeiten und Fokushöhen (z, Abstand vom ungebundenen Boden) in Gegenwart von 25 μM Tau441 (1 μM AF488-markiertes αS und Atto647N-markiertes Tau441) in einer Vertiefung einer Mikroskopplatte mit LLPS-Puffer) .Sechs Experimente wurden unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.b CF-mikroskopisches Bild von 25 μM αS in Gegenwart von 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-markiertes Tau441) und 12,5 μM Thioflavin-T (ThT).In der oberen bzw. mittleren Reihe werden gewichtete Proteintröpfchen sowie abgelagerte Proteinflöße und -flecken angezeigt.Die untere Reihe zeigt Bilder von Flößen und Abstürzen aus drei unabhängigen Replikaten.Weiße Pfeile zeigen ThT-positive Punkte in beiden Feldern an.Der Maßstabsbalken für alle Bilder beträgt 20 µm.
Um die Veränderungen im Koazervat-Proteinnetzwerk beim Übergang von flüssig zu fest genauer zu untersuchen, verwendeten wir Fluoreszenzlebensdauerbildgebung (FLIM) und Förster-Resonanzenergietransfermikroskopie (FRET) (Abbildung 6 und ergänzende Abbildungen 8 und 9).Wir stellten die Hypothese auf, dass die Koazervatreifung der Schicht zu einer stärker kondensierten oder sogar festkörperähnlichen aggregierten Proteinstruktur zu einem engeren Kontakt zwischen dem Protein und der daran befestigten Fluoreszenzsonde führt, was möglicherweise einen Löscheffekt erzeugt, der sich in einer verkürzten Sondenlebensdauer (τ) manifestiert. , wie zuvor beschrieben40.,41 ,42.Darüber hinaus kann diese Abnahme von τ bei doppelt markierten Proben (AF488 und Atto647N als FRET-Donor- bzw. -Akzeptorfarbstoffe) auch mit einer Koazervatkondensation und einer Erhöhung der FRET(E)-Effizienz während der LSPT einhergehen.Wir haben die Floß- und Spotbildung im Laufe der Zeit in LLPS-αS/Tau441- und αS/ΔNt-Tau-Proben überwacht (25 µM jedes Proteins in LLPS-Puffer mit 1 µM AF488-markiertem αS und/oder Atto647N-markiertem Tau441 oder ΔNt-Tau).Wir beobachteten einen allgemeinen Trend dahingehend, dass die Fluoreszenzlebensdauer der Sonden AF488 (τ488) und Atto647N (τ647N) mit zunehmender Reifung der Koazervate leicht abnahm (Abb. 6 und ergänzende Abb. 8c).Interessanterweise war diese Änderung bei Punkten innerhalb von Rafts deutlich verstärkt (Abb. 6c), was darauf hindeutet, dass an Punkten eine weitere Proteinkondensation stattfand.Dies wird dadurch gestützt, dass für αS/ΔNt-Tau-Tröpfchen, die 24 Stunden lang gealtert wurden, keine signifikante Änderung der Fluoreszenzlebensdauer beobachtet wurde (ergänzende Abbildung 8d), was darauf hindeutet, dass die Tröpfchengelierung ein Prozess ist, der sich von der Fleckenbildung unterscheidet und nicht mit einer signifikanten molekularen Reorganisation einhergeht innerhalb von Koazervaten.Es ist zu beachten, dass die Punkte in αS unterschiedliche Größen und variable Inhalte aufweisen, insbesondere für das αS / Tau441-System (ergänzende Abbildung 8e).Die Abnahme der Spot-Fluoreszenzlebensdauer ging mit einem Anstieg der Intensität, insbesondere für Atto647N-markiertes Tau441 (ergänzende Abbildung 8a), und höheren FRET-Effizienzen sowohl für αS/Tau441- als auch αS/ΔNt-Tau-Systeme einher, was auf eine weitere Kondensation in LLPS Five Stunden hinweist Nach dem Auslösen kondensieren die Proteine ​​im Inneren der statischen Elektrizität.Im Vergleich zu αS/ΔNt-Tau beobachteten wir in αS/Tau441-Spots niedrigere τ647N- und etwas höhere τ488-Werte, begleitet von niedrigeren und inhomogeneren FRET-Werten.Möglicherweise hängt dies mit der Tatsache zusammen, dass im αS/Tau441-System die beobachtete und erwartete αS-Häufigkeit in Aggregaten im Vergleich zu Tau heterogener und häufig unterstöchiometrisch ist, da Tau441 selbst ebenfalls LLPS und Aggregation unterliegen kann (ergänzende Abbildung 8e). .Der Grad der Tröpfchenkoaleszenz, der Floßbildung und vor allem der Proteinaggregation innerhalb flüssigkeitsähnlicher Koazervate ist jedoch maximal, wenn sowohl Tau441 als auch αS vorhanden sind.
a Lebenszeitfluoreszenzmikroskopie (FLIM)-Bilder von αS/Tau441 und αS/ΔNt-Tau bei 25 μM jedes Proteins (1 μM AF488-markiertes αS und 1 μM Atto647N-markiertes Tau441 oder ΔNt-Tau) in LLPS-Puffer.Die Spalten zeigen repräsentative Bilder von LLPS-Proben zu unterschiedlichen Reifezeiten (30 Minuten, 5 Stunden und 24 Stunden).Der rote Rahmen zeigt die Region mit αS/Tau441-Spots.Die Lebensdauer wird als Farbbalken dargestellt.Maßstabsbalken = 20 µm für alle Bilder.b Vergrößertes FLIM-Bild des ausgewählten Bereichs, angezeigt im roten Feld in Feld a.Lebensdauerbereiche werden mit derselben Farbskala wie in Tafel a dargestellt.Maßstabsbalken = 5 µm.c Histogramme, die AF488 (an αS gebunden) oder Atto647N (an Tau gebunden) für verschiedene Proteinarten (Tröpfchen-D-, Raft-R- und Speckle-P) zeigen, die in FLIM-Bildern identifiziert wurden, die für αS- aufgezeichnet wurden. Zeitverteilungen, Lebensdauer von Tau441 und αS/ΔNt-Tau-Koazervatproben (N = 17–32 ROI für D, 29–44 ROI für R und 21–51 ROI für Punkte).Mittel- und Medianwerte werden als gelbe Quadrate bzw. schwarze Linien innerhalb von Kästchen angezeigt.Die unteren und oberen Grenzen der Box stellen jeweils das erste und dritte Quartil dar, und die minimalen und maximalen Werte innerhalb des 1,5-fachen Interquartilbereichs (IQR) werden als Whiskers angezeigt.Ausreißer werden als schwarze Rauten dargestellt.Die statistische Signifikanz zwischen Verteilungspaaren wurde mithilfe eines T-Tests bei zwei Stichproben unter der Annahme ungleicher Varianzen bestimmt.Zweiseitige t-Test-p-Werte werden mit Sternchen für jedes Paar verglichener Daten angezeigt (* p-Wert > 0,01, ** p-Wert > 0,001, *** p-Wert > 0,0001, **** p-Wert > 0,00001), ns Zeigt Vernachlässigbarkeit an (p-Wert > 0,05).Die genauen p-Werte sind in der Ergänzungstabelle 1 angegeben und die Originaldaten werden als Rohdatendateien dargestellt.
Um die Amyloid-ähnliche Natur von Flecken/Aggregaten weiter zu demonstrieren, behandelten wir ungefärbte Koazervatproben 24 Stunden lang mit hohen Konzentrationen von (1 M) NaCl, was zur Trennung von Aggregaten von Proteinkoazervaten führte.Als isolierte Aggregate (d. h. eine dispergierte Lösung von Aggregaten) mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) beobachtet wurden, beobachteten wir eine überwiegend kugelförmige Morphologie mit einer regelmäßigen Höhe von etwa 15 nm, die unter Bedingungen hoher Salzkonzentration dazu neigt, sich zu assoziieren, ähnlich wie das Verhalten typischer Amyloidfibrillen aufgrund der starken hydrophoben Wirkung auf der Oberfläche (beachten Sie, dass Fibrillen typischerweise eine Höhe von ~ 10 nm haben) (ergänzende Abbildung 10a).Interessanterweise beobachteten wir bei der Inkubation isolierter Aggregate mit ThT in einem Standard-ThT-Fluoreszenzassay einen dramatischen Anstieg der ThT-Fluoreszenzquantenausbeute, vergleichbar mit dem, der beobachtet wurde, als der Farbstoff mit typischen αS-Amyloidfibrillen inkubiert wurde (ergänzende Abbildung 10b), was darauf hindeutet Die Koazervataggregate enthalten amyloidähnliche Strukturen..Tatsächlich waren die Aggregate tolerant gegenüber hohen Salzkonzentrationen, aber empfindlich gegenüber 4 M Guanidinchlorid (GdnHCl), wie typische Amyloidfibrillen (ergänzende Abbildung 10c).
Als nächstes analysierten wir die Zusammensetzung der Aggregate mittels Einzelmolekülfluoreszenz, spezifischer Fluoreszenzkorrelations-/Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCS/FCCS) und Burst-Analyse der Zweifarben-Koinzidenzerkennung (TCCD).Zu diesem Zweck isolierten wir Aggregate, die nach 24-stündiger Inkubation in 100 μl LLPS-Proben mit αS und Tau441 (beide 25 μM) zusammen mit 1 μM AF488-markiertem αS und 1 μM Atto647N-markiertem Tau441 gebildet wurden.Verdünnen Sie die resultierende dispergierte Aggregatlösung mit demselben PEG-freien Puffer und 1 M NaCl (dem gleichen Puffer, der zum Trennen von Aggregaten vom Koazervat verwendet wird) auf einen monomolekularen Zustand, um mögliche elektrostatische Wechselwirkungen zwischen LLPS und Protein zu verhindern.Ein Beispiel für den zeitlichen Verlauf eines einzelnen Moleküls ist in Abb. 7a zu sehen.Die FCCS/FCS-Analyse (Kreuzkorrelation, CC und Autokorrelation, AC) zeigte, dass Aggregate, die αS und Tau enthielten, in den Proben reichlich vorhanden waren (siehe CC-Kurve in Abb. 7b, linkes Feld) und ein Überschuss an restlichem Monomerprotein auftrat Ergebnis des Verdünnungsprozesses (siehe AC-Kurven in Abbildung 7b, linkes Feld).Kontrollexperimente, die unter denselben Lösungsbedingungen mit Proben durchgeführt wurden, die nur Monomerproteine ​​enthielten, zeigten keine CC-Kurven, und die AC-Kurven passen gut zum Einkomponenten-Diffusionsmodell (Gleichung 4), bei dem Monomerproteine ​​die erwarteten Diffusionskoeffizienten aufweisen (Abb. 7b). ), rechtes Feld).Der Diffusionskoeffizient aggregierter Partikel beträgt weniger als 1 µm2/s, der von Monomerproteinen etwa 1 µm2/s.50–100 µm/s;Die Werte ähneln zuvor veröffentlichten Werten für beschallte αS-Amyloidfibrillen und Monomer-αS getrennt unter ähnlichen Lösungsbedingungen44.Als wir die Aggregate mit der TCCD-Explosionsanalyse analysierten (Abb. 7c, oberes Feld), stellten wir fest, dass in jedem isolierten Aggregat (αS/Tau-Heteroaggregat) etwa 60 % der nachgewiesenen Aggregate sowohl αS als auch Tau enthielten, etwa 30 % nur Tau, nur etwa 10 % αS.Die stöchiometrische Analyse von αS/Tau-Heteroaggregaten zeigte, dass die meisten Heteroaggregate mit Tau angereichert waren (Stöchiometrie unter 0,5, die durchschnittliche Anzahl von Tau-Molekülen pro Aggregat ist viermal höher als die von αS-Molekülen), was mit unserer in FLIM in situ beobachteten Arbeit übereinstimmt Experimente..Die FRET-Analyse zeigte, dass diese Aggregate beide Proteine ​​enthielten, obwohl die tatsächlichen FRET-Werte in diesem Fall nicht von großer Bedeutung sind, da die Verteilung der Fluorophore in jedem Aggregat aufgrund eines Überschusses an unmarkiertem Protein, das im Experiment verwendet wurde, zufällig war.Als wir die gleiche Analyse mit der 45,46 reifen Amyloid-Aggregations-defizienten Tau-Variante durchführten (siehe ergänzende Abbildung 11a, b), stellten wir interessanterweise fest, dass die elektrostatische αS-Aggregation zwar dieselbe war (ergänzende Abbildung 11c, d), die Fähigkeit, Aggregate innerhalb des Koazervats zu bilden, wurde drastisch reduziert und FLIM entdeckte mehrere Stellen in In-situ-Experimenten, und für isolierte Aggregatproben wurden schwache Kreuzkorrelationskurven beobachtet.Bei einer kleinen Anzahl detektierter Aggregate (nur ein Zehntel von Tau441) beobachteten wir jedoch, dass jedes Aggregat an αS angereichert war als diese Tau-Variante, wobei etwa 50 % der detektierten Aggregate nur αS-Moleküle enthielten und αS im Überschuss heterogen war .Aggregate (siehe ergänzende Abbildung 11e), im Gegensatz zu den heterogenen Aggregaten, die von Tau441 erzeugt werden (Abb. 6f).Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass αS selbst zwar in der Lage ist, sich mit Tau innerhalb des Koazervats anzureichern, die Tau-Keimbildung unter diesen Bedingungen jedoch günstiger ist und die resultierenden amyloidähnlichen Aggregate in der Lage sind, als eine Form von αS und Tau zu wirken.Sobald jedoch ein Tau-reicher Kern gebildet ist, werden heterotypische Wechselwirkungen zwischen αS und Tau in Aggregaten gegenüber homotypischen Wechselwirkungen zwischen Tau-Molekülen bevorzugt;Wir beobachten auch Proteinnetzwerke in flüssigen αS/Tau-Koazervaten.
a Repräsentative zeitliche Fluoreszenzspuren einzelner Moleküle isolierter Aggregate, die in elektrostatischen αS/Tau441-Koazervaten gebildet werden.Ausbrüche entsprechend αS/Tau441-Koaggregaten (Ausbrüche über dem angegebenen Schwellenwert) wurden in drei Detektionskanälen beobachtet (AF488- und Atto647N-Emission nach direkter Anregung, blaue und rote Linien, Atto647N-Emission nach indirekter Anregung), FRET, violette Linie).b FCS/FCCS-Analyse einer Probe isolierter αS/Tau441-Aggregate, erhalten von LLPS (linkes Feld).Autokorrelationskurven (AC) für AF488 und Atto647N sind in Blau bzw. Rot dargestellt, und Kreuzkorrelationskurven (CC), die mit Aggregaten verbunden sind, die beide Farbstoffe enthalten, sind in Lila dargestellt.Die AC-Kurven spiegeln das Vorhandensein markierter Monomer- und aggregierter Proteinspezies wider, während die CC-Kurven nur die Diffusion doppelt markierter Aggregate zeigen.Dieselbe Analyse, aber unter den gleichen Lösungsbedingungen wie an isolierten Stellen. Proben, die nur monomeres αS und Tau441 enthalten, werden im rechten Feld als Kontrollen angezeigt.c Fluoreszenzblitzanalyse einzelner Moleküle isolierter Aggregate, die in elektrostatischen αS/Tau441-Koazervaten gebildet werden.Informationen für jedes Aggregat, das in vier verschiedenen Wiederholungen (N = 152) gefunden wurde, werden gegen ihre Stöchiometrie, S-Werte und FRET-Effizienz aufgetragen (oberes Feld, Farbbalken spiegelt das Vorkommen wider).Es können drei Arten von Aggregaten unterschieden werden: Nur-αS-Aggregate mit S~1 und FRET~0, Nur-Tau-Aggregate mit S~0 und FRET~1 und heterogene Tau/αS-Aggregate mit dazwischen liegenden S und FRET. Schätzungen der Menge der beiden Markerproteine, die in jedem heterogenen Aggregat (N = 100) nachgewiesen wurden, sind im unteren Feld dargestellt (die Farbskala spiegelt das Vorkommen wider).Rohdaten werden in Form von Rohdatendateien bereitgestellt.
Es wurde berichtet, dass die Reifung oder Alterung von flüssigen Proteinkondensaten zu gelartigen oder festen Strukturen im Laufe der Zeit an mehreren physiologischen Funktionen des Kondensats beteiligt ist47 sowie an Krankheiten als abnormaler Prozess, der der Amyloidaggregation vorausgeht 7, 48, 49. Hier Wir untersuchen Phasentrennung und -verhalten im Detail.LSPT αS in Gegenwart zufälliger Polykationen in einer kontrollierten Umgebung bei niedrigen mikromolaren Konzentrationen und physiologisch relevanten Bedingungen (beachten Sie, dass die berechnete physiologische Konzentration von αS >1 µM50 beträgt), entsprechend dem typischen thermodynamischen Verhalten von LPS.Wir fanden heraus, dass αS, das bei physiologischem pH-Wert eine stark negativ geladene C-terminale Region enthält, über LLPS in Gegenwart von stark kationisch ungeordneten Peptiden wie pLK oder Tau durch den elektrostatischen Prozess proteinreiche Tröpfchen in wässriger Lösung bilden kann komplexe Kondensation in Gegenwart von Aggregationsmakromolekülen.Dieser Prozess kann relevante Auswirkungen auf die zelluläre Umgebung haben, wo αS sowohl in vitro als auch in vivo auf verschiedene polykationische Moleküle trifft, die mit seiner krankheitsbedingten Aggregation verbunden sind51,52,53,54.
In vielen Studien wurde die Proteindynamik innerhalb von Tröpfchen als einer der Schlüsselfaktoren für den Reifungsprozess angesehen55,56.In elektrostatischen αS-Koazervaten mit Polykationen hängt der Reifungsprozess offenbar von der Stärke der Wechselwirkungen mit Polykationen, der Valenz und der Vielfalt dieser Wechselwirkungen ab.Die Gleichgewichtstheorie legt nahe, dass eine Gleichgewichtslandschaft aus zwei flüssigen Zuständen das Vorhandensein eines großen Tröpfchens wäre, das reich an Biopolymeren ist, die LLPS antreiben57,58.Tröpfchenwachstum kann durch Ostwald-Reifung59, Koaleszenz60 oder Verbrauch von freiem Monomer in der dispergierten Phase61 erreicht werden.Für αS und Tau441, ΔNt-Tau oder pLK wurde unter den in dieser Studie verwendeten Bedingungen der größte Teil des Proteins im Kondensat konzentriert.Während jedoch Tau-Tröpfchen in voller Größe bei Oberflächenbenetzung schnell koaleszierten, waren die Koaleszenz und Benetzung der Tröpfchen für ΔNt-Tau und pLK schwierig, was auf einen schnellen Verlust der Flüssigkeitseigenschaften in diesen beiden Systemen schließen lässt.Laut unserer FLIM-FRET-Analyse zeigten die gealterten pLK- und ΔNt-Tau-Tröpfchen einen ähnlichen Grad an Proteinaggregation (ähnliche Fluoreszenzlebensdauer) wie die ursprünglichen Tröpfchen, was darauf hindeutet, dass das ursprüngliche Proteinnetzwerk erhalten blieb, wenn auch starrer.
Wir rationalisieren unsere experimentellen Ergebnisse im folgenden Modell (Abbildung 8).Bei den anfänglich vorübergehend gebildeten Tröpfchen handelt es sich häufig um Proteinnetzwerke ohne elektrostatische Kompensation, sodass es insbesondere an der Tröpfchengrenzfläche zu Ladungsungleichgewichten kommt, die zu Tröpfchen mit einem hohen elektrostatischen Oberflächenpotential führen.Um die Ladung zu kompensieren (ein Phänomen, das üblicherweise als Valenzverarmung bezeichnet wird) und das Oberflächenpotential der Tröpfchen zu minimieren, können die Tröpfchen neue Polypeptide aus der verdünnten Phase aufnehmen, Proteinnetzwerke neu organisieren, um Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen zu optimieren, und mit anderen Tröpfchen interagieren.mit Oberflächen (Benetzung).Die αS/pLK-Tröpfchen scheinen aufgrund ihres einfacheren Proteinnetzwerks (nur heterotypische Wechselwirkungen zwischen αS und pLK) und ihrer größeren Affinität für Protein-Protein-Wechselwirkungen in der Lage zu sein, die Ladung des Kondensats schneller auszugleichen;Tatsächlich beobachteten wir eine schnellere Proteinkinetik in ursprünglich gebildeten αS/pLK-Koazervaten als in αS/Tau.Nach der Valenzverarmung werden die Wechselwirkungen weniger kurzlebig und die Tröpfchen verlieren ihre flüssigen Eigenschaften und verwandeln sich in gelartige, nicht brennbare Tröpfchen mit einem niedrigen elektrostatischen Oberflächenpotential (und sind daher nicht in der Lage, die Oberfläche zu benetzen).Im Gegensatz dazu sind αS/Tau-Tröpfchen aufgrund komplexerer Proteinnetzwerke (sowohl mit homotypischen als auch heterotypischen Wechselwirkungen) und der schwächeren Natur der Proteinwechselwirkungen weniger effizient bei der Optimierung des Ladungsgleichgewichts der Tröpfchen.Dies führt zu Tröpfchen, die ihr Flüssigkeitsverhalten über längere Zeiträume beibehalten und ein hohes elektrostatisches Oberflächenpotential aufweisen, das tendenziell durch Koaleszenz und Wachstum (wodurch das Verhältnis von Oberfläche zu Volumen der Tröpfchen minimiert wird) und durch Benetzen der hydrophilen Oberflächenchemikalie minimiert wird.Dadurch entstehen große konzentrierte Proteinbibliotheken, die ihre flüssigen Eigenschaften beibehalten, da die Wechselwirkungen aufgrund der ständigen Suche nach Ladungsoptimierung im Proteinnetzwerk sehr vorübergehend bleiben.Interessanterweise zeigen N-terminal verkürzte Formen von Tau, einschließlich einiger natürlich vorkommender Isoformen62, ein intermediäres Verhalten, wobei einige Koazervate mit αS zu langlebigen gelartigen Tröpfchen altern, während andere sich in große flüssige Kondensate umwandeln.Diese Dualität bei der Reifung von elektrostatischen αS-Koazervaten steht im Einklang mit jüngsten theoretischen und experimentellen LLPS-Studien, die einen Zusammenhang zwischen Valenzverarmung und elektrostatischer Siebung in Kondensaten als Schlüssel zur Steuerung der Kondensatgröße und der Flüssigkeitseigenschaften identifiziert haben.Mechanismus 58.61.
Dieses Schema zeigt den mutmaßlichen Amyloid-Aggregationsweg für αS und Tau441 über LLPS und LSPT.Mit zusätzlichen anionenreichen (rot) und kationenreichen (blau) Regionen weisen elektrostatische αS- und Tau-Koazervate mit zufriedenstellender Wertigkeit eine niedrigere Oberflächenenergie und daher weniger Koaleszenz auf, was zu einer schnellen Tröpfchenalterung führt.Es wird ein stabiler, nicht agglomerierter Gelzustand erreicht..Diese Situation ist im Fall des αS/pLK-Systems aufgrund seiner höheren Affinität und des einfacheren Proteinpaar-Interaktionsnetzwerks sehr günstig, was einen schnellen gelartigen Übergang ermöglicht.Im Gegenteil, Tröpfchen mit unbefriedigender Wertigkeit und damit proteinbeladenen Regionen, die für eine Wechselwirkung zur Verfügung stehen, erleichtern es dem Koazervat, zu fusionieren und die hydrophile Oberfläche zu benetzen, um so seine hohe Oberflächenenergie zu reduzieren.Diese Situation ist für αS/Tau441-Koazervate vorzuziehen, die ein multivalentes komplexes Netzwerk bestehend aus schwachen Tau-Tau- und αS-Tau-Wechselwirkungen aufweisen.Größere Koazervate behalten wiederum ihre flüssigkeitsähnlichen Eigenschaften leichter bei, sodass andere Protein-zu-Protein-Wechselwirkungen stattfinden können.Schließlich bilden sich in der Koazervatflüssigkeit heterogene Amyloidaggregate, die sowohl αS als auch Tau enthalten, was möglicherweise mit denen in Einschlusskörperchen verwandt ist, die ein Kennzeichen neurodegenerativer Erkrankungen sind.
Die großen flüssigkeitsähnlichen Strukturen, die während der Reifung von αS/Tau441 mit einer stark überfüllten, aber dynamischen Proteinumgebung und in geringerem Maße αS/ΔNt-Tau-Koazervate gebildet werden, sind ideale Reservoire für die Keimbildung der Proteinaggregation.Wir haben tatsächlich die Bildung fester Proteinaggregate in dieser Art von Proteinkoazervaten beobachtet, die oft sowohl αS als auch Tau enthalten.Wir haben gezeigt, dass diese Heteroaggregate durch nicht-elektrostatische Wechselwirkungen stabilisiert werden, in der Lage sind, amyloidspezifische ThT-Farbstoffe auf die gleiche Weise wie typische Amyloidfibrillen zu binden, und tatsächlich eine ähnliche Resistenz gegenüber verschiedenen Einflüssen aufweisen.Es wurde gezeigt, dass die durch LLPS gebildeten αS/Tau-Aggregate amyloidähnliche Eigenschaften haben.Tatsächlich ist die reife Variante von Tau, der es an Amyloidaggregation mangelt, bei der Bildung dieser heterogenen αS-Aggregate innerhalb des flüssigen elektrostatischen Koazervats erheblich beeinträchtigt.Die Bildung von αS/Tau441-Aggregaten wurde nur innerhalb der Koazervate beobachtet, die ihre flüssigkeitsähnlichen Eigenschaften beibehielten, und nie, wenn die Koazervate/Tröpfchen nicht den Gelzustand erreichten.Im letzteren Fall verhindern die erhöhte Stärke elektrostatischer Wechselwirkungen und die daraus resultierende Starrheit des Proteinnetzwerks die notwendigen Konformationsumlagerungen von Proteinen, um neue Proteinwechselwirkungen zu etablieren, die für die Amyloidkeimbildung erforderlich sind.Dies kann jedoch mit flexibleren, flüssigkeitsähnlichen Koazervaten erreicht werden, die wiederum mit zunehmender Größe eher flüssig bleiben.
Die Tatsache, dass die Bildung von Aggregaten innerhalb der kondensierten Phase in großen αS/Tau-Kondensaten bevorzugt ist als in kleinen Tröpfchen, die schnell gelieren, unterstreicht die Relevanz der Identifizierung der Faktoren, die die Tröpfchenkoaleszenz steuern.Somit besteht nicht nur die Tendenz zur Phasentrennung, sondern auch die Größe des Kondensats muss kontrolliert werden, um eine ordnungsgemäße Funktion sowie die Vorbeugung von Krankheiten zu gewährleisten58,61.Unsere Ergebnisse unterstreichen auch die Bedeutung des Gleichgewichts zwischen LLPS und LSPT für das αS/Tau-System.Während die Tröpfchenbildung vor Amyloidaggregation schützen kann, indem sie die Menge der unter Sättigungsbedingungen verfügbaren Proteinmonomere verringert, wie in anderen Systemen vorgeschlagen wurde63,64, kann die Tröpfchenfusion bei hohen Tröpfchenkonzentrationen zu einer internen Proteinaggregation durch langsame Konformationsumlagerungen führen.Proteinnetzwerke..
Insgesamt unterstreichen unsere Daten stark die Relevanz kohäsiver Valenz und zufriedener/unzufriedener Interaktionen in Drop-Netzwerken im Kontext von LSPT.Insbesondere zeigen wir, dass αS/Tau441-Kondensate in voller Länge effizient fusionieren und Keime bilden können, um amyloidähnliche Heteroaggregate zu bilden, die beide Proteine ​​umfassen, und schlagen auf der Grundlage unserer experimentellen Ergebnisse einen molekularen Mechanismus vor.Die Co-Aggregation zweier Proteine ​​im αS/Tau-Flüssigkeitskoazervat, über die wir hier berichten, könnte tatsächlich mit der Co-Lokalisierung zweier Proteine ​​in Einschlüssen zusammenhängen, die Kennzeichen der Krankheit sind, und könnte zum Verständnis der Beziehung zwischen LLPS und beitragen Amyloidaggregation, die den Weg für hoch geladenes IDP bei der Neurodegeneration ebnet.
Monomere WT-αS-, Cysteinmutanten (Q24C-αS, N122C-αS) und ΔCt-αS-Varianten (Δ101-140) wurden in E. coli exprimiert und wie zuvor beschrieben gereinigt.5 mM DTT wurden in allen Schritten der Reinigung von αS-Cysteinmutanten einbezogen, um die Bildung von Disulfidbindungen zu verhindern.Tau441-Isoform (Plasmid erhalten von Addgene #16316), ΔNt-Tau-Variante (Δ1–150, erhalten durch Klonierung von IVA mit den Primern CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) und AggDef-Tau-Variante (Δ275–311, gereinigt mit GGCTC5-Primer) E. coli-Kulturen waren bei 37 °C und 180 U/min auf OD600 = 0,6–0,7 gezüchtet und die Expression wurde mit IPTG für 3 Stunden bei 37 °C induziert.Ernten Sie Zellen bei 11.500 xg für 15 min bei 4 °C und waschen Sie sie mit Salzpuffer, der 150 mM NaCl enthält.Resuspendieren Sie das Pellet in Lysepuffer (20 ml pro 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, Benzamidin 50 μM, Copeptin 100 μM).Der Beschallungsschritt wurde auf Eis mit einer Amplitude von 80 % für 10 Impulse (1 Minute an, 1 Minute aus) durchgeführt.Überschreiten Sie nicht 60 ml pro Ultraschall.E. coli-Lysate wurden 20 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, dann auf Eis abgekühlt und 40 Minuten lang bei 127.000 × g zentrifugiert.Der geklärte Überstand wurde auf eine 3,5 kDa-Membran (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, UK) aufgetragen und gegen 4 l Dialysepuffer (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM) dialysiert , PMSF 0,1 mM) für 10 Stunden.Eine 5-ml-Kationenaustauschersäule (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) wurde mit Äquilibrierungspuffer (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF) äquilibriert.Das Tau-Lysat wurde durch einen 0,22 μm PVDF-Filter filtriert und mit einer Flussrate von 1 ml/min in die Säule injiziert.Die Elution erfolgte schrittweise, Tau wurde mit 15–30 % Elutionspuffer (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF) eluiert.Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und alle Fraktionen, die eine Bande mit dem erwarteten Molekulargewicht von Tau enthielten, wurden unter Verwendung eines 10-kDa-Zentrifugenfilters konzentriert und durch einen Puffer ersetzt, der 10 mM HEPES, pH 7,4, 500 mM NaCl und 2 mM DTT enthielt die endgültige Proteinkonzentration betrug 100 μM.Die Proteinlösung wurde dann durch einen 0,22 μm PVDF-Filter geleitet, schnell eingefroren und bei –80 °C gelagert.Protein K18 wurde freundlicherweise von Prof. Alberto Boffi zur Verfügung gestellt.Die Reinheit des Präparats betrug >95 %, wie durch SDS-PAGE und MALDI-TOF/TOF bestätigt.Verschiedene Cysteine ​​wurden chemisch mit AlexaFluor488-Maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) oder TEMPOL-Maleimid (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada) markiert.wurden durch Absorption und MALDI-TOF/TOF bestätigt.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau und K18 wurden mit nativen Cysteinresten an den Positionen 191 und 322 unter Verwendung von Atto647N-Maleimid (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Deutschland) nach dem gleichen Verfahren markiert.Nettoladungskarten pro Rest für αS und Tau441 wurden mit CIDER66 erstellt.
Festes Poly-L-Lysin (pLK DP 90–110 gemäß NMR des Lieferanten Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) wurde in 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 bis 10 mM Konzentration gelöst und 5 Minuten lang mit Ultraschall behandelt Minuten in einem Ultraschall-Wasserbad und bei -20°C lagern.PEG-8, Dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) und FITC-Dextran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) sind wasserlöslich und im LLPS-Puffer weit verbreitet.Durch die Dialyse werden kontaminierende Salze entfernt.Anschließend wurden sie durch einen Spritzenfilter mit einer Porengröße von 0,22 μm filtriert und ihre Konzentrationen mit einem Refraktometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA) berechnet.LLPS-Proben wurden bei Raumtemperatur in der folgenden Reihenfolge hergestellt: Puffer und Extrusion wurden gemischt und 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethan- 1,2-Diyldinitril) Tetraessigsäure (EDTA, Carboxynth) und eine Mischung aus 1 % Proteaseinhibitor (PMSF 100 mM, Benzimid 1 mM, Leupeptin 5 μM).Dann werden αS und kondensierte Polykationen (Optionen pLK oder Tau) hinzugefügt.Für Thioflavin-T-Zeitreihenexperimente (ThT, Carbosynth, Compton, UK) verwenden Sie die Gesamt-ThT-Konzentration so, dass sie halb so groß ist wie die αS-Konzentration.Mischen Sie die Proben vorsichtig, aber gründlich, um sicherzustellen, dass sie homogen sind.Die Konzentration jeder Komponente variierte von Experiment zu Experiment, wie im Abschnitt „Ergebnisse“ beschrieben.Azid wurde in einer Konzentration von 0,02 % (Gew./Vol.) verwendet, wann immer die Dauer des Experiments 4 Stunden überschritt.Lassen Sie bei allen Analysen mit LLPS-Proben die Mischung vor der Analyse 5 Minuten lang äquilibrieren.Für die Lichtstreuungsanalyse wurden 150 µl Proben auf nicht bindende 96-Well-Mikrotiterplatten (µClear®, schwarz, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Österreich) geladen und mit Klebefolie abgedeckt.LLPs wurden durch Messung der Absorption bei 350 nm im Zentrum der Lösung in einem CLARIOstar-Plattenlesegerät (BMG Labtech, Ortenberg, Deutschland) überwacht.Die Experimente wurden dreifach bei 25 °C durchgeführt und die Fehler wurden als Standardabweichung vom Mittelwert berechnet.Die verdünnte Phase wurde durch Probenzentrifugation und SDS-PAGE-Gelanalyse quantifiziert, und der αS-Anteil in der verdünnten und konzentrierten Phase wurde in verschiedenen LLPS-Lösungen quantifiziert.Eine 100 μl LLPS-Probe mit 1 μM AF488-markiertem αS wurde durch gründliches Mischen und anschließende 30-minütige Zentrifugation bei 9600 × g hergestellt, wonach der Niederschlag normalerweise sichtbar war.Die oberen 50 μl des Überstands wurden zur Proteinquantifizierung mittels SDS-PAGE-Gel verwendet.Die Gele wurden mit AF488-Filtern unter Verwendung eines ChemiDoc-Gelbildgebungssystems (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) gescannt oder mit Coomassie-Färbung gefärbt und mit geeigneten Filtern sichtbar gemacht.Die resultierenden Banden wurden mit ImageJ Version 1.53i (National Institutes of Health, USA) analysiert.Die Experimente wurden doppelt in zwei verschiedenen Experimenten mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
Typischerweise wurden 150 μl Proben auf nicht bindende 96-Well-Mikrotiterplatten aufgetragen und bei Raumtemperatur auf einem Leica DMI6000B-Umkehrmikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) sichtbar gemacht.Für Spotexperimente wurden auch µ-Slide Angiogenesis-Platten (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Deutschland) oder 96-Well-Polystyrol-Mikroplatten (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) verwendet.Als Beleuchtungsquellen wurden EL6000-Halogen- oder Quecksilber-Halogenmetalldampflampen verwendet (für BF/DIC- bzw. WF-Bildgebung).Für die WF-Mikroskopie wurde ein Luftobjektiv mit 40-facher Vergrößerung (Leica Microsystems, Deutschland) verwendet, um das Licht auf die Probe zu fokussieren und zu sammeln.Filtern Sie für AF488- und ThT-markierte Proben die Anregung und Emission mit Standard-GFP-Filtersätzen, Anregungs- und Emissionsbandpassfiltern, 460–500-nm- bzw. 512–542-nm-Bandpassfiltern und einem dichroitischen 495-nm-Spiegel.Für mit Atto647N markierte Proben wurden ein Standardsatz von Cy5-Filtern mit Anregungs- und Emissionsbandpassfiltern von 628–40 nm bzw. 692–40 nm und ein dichroitischer 660-nm-Spiegel verwendet.Verwenden Sie für die BF- und DIC-Mikroskopie dasselbe Reflexionslicht-Sammelobjektiv.Das gesammelte Licht wurde mit einer Leica DFC7000 CCD-Kamera (Leica Microsystems, Deutschland) aufgezeichnet.Die Belichtungszeit betrug 50 ms für die BF- und DIC-Mikroskopie-Bildgebung und 20–100 ms für die WF-Mikroskopie-Bildgebung.Zum Vergleich: Die Belichtungszeit für alle Experimente mit ThT betrug 100 ms.Zur Visualisierung der Tröpfchenkoaleszenz wurden Zeitrafferexperimente durchgeführt, wobei mehrere Minuten lang alle 100 ms Bilder aufgenommen wurden.ImageJ (NIH, USA) wurde für die Bildanalyse verwendet.Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
Für Kolokalisierungsexperimente, FRAP und 3D-Rekonstruktion wurden Bilder mit einem inversen konfokalen Zeiss LSM 880-Mikroskop unter Verwendung einer ZEN 2 Blue Edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland) aufgenommen.Proben von 50 µl wurden auf µ-Slide Angiogenesis Petrischalen (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Deutschland) aufgetragen, mit einem hydrophilen Polymer (ibiTreat) behandelt und in ein 63× Ölimmersionsobjektiv (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) montiert. auf DIC).Die Bilder wurden mit 458-nm-, 488-nm- und 633-nm-Argonlaserlinien mit einer Auflösung von 0,26 µm/Pixel und einer Belichtungszeit von 8 µs/Pixel für Anregungs- und Emissionsdetektionsfenster von 470–600 nm, 493–628 nm, und 638–755 nm wurden zur Visualisierung von ThT, AF488 bzw. Atto647N verwendet.Für die FRAP-Experimente wurde eine Zeitrafferfotografie jeder Probe mit 1 Bild pro Sekunde aufgenommen.Die Experimente wurden dreifach bei Raumtemperatur mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.Alle Bilder wurden mit der Software Zen 2 Blue Edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Deutschland) analysiert.Die FRAP-Kurven wurden normalisiert, aufgezeichnet und an Intensitäts-/Zeitdaten angepasst, die mit Zen 2 und OriginPro 9.1 aus Bildern extrahiert wurden.Die Erholungskurven wurden an ein monoexponentielles Modell angepasst, um die molekulare Diffusion mit einem zusätzlichen Exponentialterm zu berücksichtigen, um den Akquisitionsbleicheffekt zu berücksichtigen.Anschließend berechneten wir D unter Verwendung des nominellen Bleichradius und der zuvor bestimmten Erholungshalbwertszeit wie in der Gleichung von Kang et al.5 35 dargestellt.
Einzelne Cysteinvarianten von αS wurden mit 4-Hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL) an den Positionen 24 (TEMPOL-24-αS) und 122 (TEMPOL-122-αS) synthetisiert. jeweils.Spin-Labeling Für EPR-Experimente wurde die αS-Konzentration auf 100 μM und die PEG-Konzentration auf 15 % (w/v) eingestellt.Für verschiedene Aggregationsbedingungen betrug das Verhältnis αS:pLK 1:10, während die Verhältnisse αS:ΔNt-Tau und αS:Tau441 bei 1:1 gehalten wurden.Für Bindungstitrationsexperimente ohne Überfüllung wurde TEMPOL-122-αS bei 50 μM gehalten und Polykationen wurden bei steigenden Konzentrationen titriert, wobei jede Bedingung separat vorbereitet wurde.CW-EPR-Messungen wurden mit einem Bruker ELEXSYS E580 X-Band-Spektrometer durchgeführt, das mit einem Bruker ER4118 SPT-N1-Resonator ausgestattet ist, der bei einer Mikrowellenfrequenz (SHF) von ~9,7 GHz arbeitet.Die Temperatur wurde auf 25°C eingestellt und durch einen Kryostaten mit flüssigem Stickstoff kontrolliert.Die Spektren wurden unter ungesättigten Bedingungen bei einer MW-Leistung von 4 mW, einer Modulationsamplitude von 0,1 mT und einer Modulationsfrequenz von 100 kHz aufgenommen.Die Spektralintensitäten wurden normalisiert, um Unterschiede in den Spinkonzentrationen zwischen Proben und eine mögliche Spinreduktion aufgrund von Restkonzentrationen an Reduktionsmitteln in Proben, die Tau441 oder ΔNt-Tau (in den ursprünglichen Proteinlösungen vorhanden) enthielten, zu vermeiden.Die angegebenen g-Werte wurden als Ergebnis einer EPR-Spektralmodellierung erhalten, die mit der in Matlab®67 implementierten Easyspin-Software (Version 6.0.0-dev.34) durchgeführt wurde.Zur Modellierung der Daten wurden ein-/zweikomponentige isotrope Modelle verwendet.Nach der Normalisierung aller Signale wurden die Residuen berechnet, indem jede Simulation vom entsprechenden experimentellen Spektrum subtrahiert wurde.Für die Bindungstitrationsanalyse wurde die relative Intensität der dritten Bande zur zweiten Bande des normalisierten EPR-Spektrums (IIII/III) verwendet, um die Bindung von Polykationen an αS zu überwachen.Um die Dissoziationskonstante (Kd) abzuschätzen, wurde die resultierende Kurve an ein Näherungsmodell angepasst, das von n identischen und unabhängigen Bindungsstellen ausgeht.
NMR-Spektroskopieexperimente wurden mit einem Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR-Spektrometer durchgeführt, das mit einer Kryosonde und einem Z-Gradienten ausgestattet war.Alle Experimente wurden mit 130–207 µM αS und entsprechenden αS/ΔNt-Tau- und pLK-Äquivalenten in 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 % DO, pH 7,4 und bei 15 °C durchgeführt.Um LPS mittels NMR zu überwachen, wurden den vorgemischten Proben 10 % PEG zugesetzt.Das Diagramm der Störung der chemischen Verschiebung (Abb. 1b) zeigt die durchschnittlichen chemischen Verschiebungen bei 1H und 15N.Die αS 2D1H-15N HSQC-Spektren wurden auf der Grundlage einer früheren Zuordnung zugeordnet (BMRB-Eintrag Nr. 25227) und durch Aufzeichnung und Analyse der 3D-Spektren von HNCA, HNCO und CBCAcoNH bestätigt.Die chemischen Verschiebungen von 13Cα und 13Cβ wurden in Gegenwart von ΔNt-Tau oder pLK berechnet, um mögliche Änderungen der Sekundärstrukturtrends im Vergleich zu chemischen Verschiebungen von αS in der reinen Random-Coil-Konformation 68 zu messen (ergänzende Abbildung 5c).Die R1ρ-Raten wurden durch Aufzeichnen von hsqctretf3gpsi-Experimenten (aus der Bruker-Bibliothek erhalten) mit Verzögerungen von 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 und 800 ms gemessen, und die Exponentialfunktionen wurden an die Spitzenintensitätsverzögerungen bei verschiedenen angepasst Zeiten, um R1ρ und seine experimentelle Unsicherheit zu bestimmen.
Zeitaufgelöste Zweifarben-Fluoreszenzmikroskopie-Experimente wurden mit einem kommerziellen zeitaufgelösten konfokalen MT200-Fluoreszenzmikroskop (PicoQuant, Berlin, Deutschland) mit einem zeitkorrelierten Einzelphotonenzählgerät (TCSPC) durchgeführt.Der Laserdiodenkopf dient zur gepulsten verschachtelten Anregung (PIE), der Strahl durchläuft einen Single-Mode-Wellenleiter und ist auf eine Laserleistung von 10 bis 100 nW für 481-nm- und 637-nm-Laserlinien abgestimmt, gemessen nach einem dichroitischen Spiegel.Dies gewährleistet eine optimale Photonenzählrate und vermeidet die Auswirkungen von Photonen-Aliasing, Photobleichung und Sättigung.μ-Slide-Angiogenese-Deckgläser oder -Platten (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Deutschland) wurden direkt in Immersionswasser über einer Super Apochromat 60x NA 1.2-Linse mit Korrekturkragen (Olympus Life Sciences, Waltham, USA) platziert.Als Hauptstrahlteiler wurde ein dichroitischer 488/640-nm-Spiegel (Semrock, Lake Forest, IL, USA) verwendet.Unfokussierte Strahlung wird durch ein Loch mit einem Durchmesser von 50 Mikrometern blockiert, dann wird die fokussierte Strahlung durch einen 50/50-Strahlteiler in zwei Detektionspfade aufgeteilt.Vor dem Detektor wurden Bandpass-Emissionsfilter (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 für grünen Farbstoff (AF488) und 690/70 für roten Farbstoff (Atto647N) verwendet.Als Detektoren wurden Single-Photon-Avalanche-Dioden (SPAD) (Micro Photon Devices, Bozen, Italien) verwendet.Sowohl die Datenerfassung als auch die Analyse wurden mit der kommerziell erhältlichen SymphoTime64-Software (PicoQuant GmbH, Berlin, Deutschland) durchgeführt.
Fünfzig Mikroliter LLPS-Proben wurden auf μ-Slide-Angiogenesevertiefungen (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Deutschland) aufgetragen.Die resultierenden Bilder werden auf 20 µm über dem Bohrlochboden fokussiert, um einen optimalen objektiven Arbeitsabstand für schwebende Tröpfchen zu gewährleisten, und auf ~1 µm für Rafts und Punkte mit einer axialen Auflösung von mindestens 0,25 µm/Pixel und einer Verzögerungszeit von 400 µs/Pixel.Wählen Sie Daten aus, indem Sie einen Intensitätsschwellenwert anwenden, der auf der durchschnittlichen Hintergrundsignalintensität (PBG, Mittelwert + 2σ) für jeden Kanal basiert, sodass nur flüssige Proteintröpfchen, Flöße oder Flecken ausgewählt werden und alle möglichen Ursprünge aus der dispergierten Phase herausgefiltert werden.Um die Lebensdauer jeder Spezies (τ) jedes Kanals (grün, „g“ für AF488 und rot, „r“ für Atto647N) zu analysieren, haben wir Regionen von Interesse (ROIs) ausgewählt, die Tröpfchen, Flöße oder Flecken enthalten (ergänzende Abbildung 1). ).8b) und leitete sie ab, indem ihr Lebensdauerzerfall (τD, τR und τP für Tröpfchen, Flöße bzw. Flecken, siehe ergänzende Abbildung 8c) in jedem Kanal mithilfe einer Tail-Fit-Analyse und eines Zweikomponenten-Zerfallsmodells angepasst wurde.Durchschnittliches τ aus τ .ROIs, die zu wenig Photonen für eine multiexponentielle Anpassung erzeugten, wurden von der Analyse ausgeschlossen.Der verwendete Grenzwert lag bei <104 Photonen für Flöße und Punkte und 103 für Tropfen.Die Tröpfchen haben einen niedrigeren Schwellenwert, da es schwierig ist, Abklingkurven mit höheren Intensitätswerten zu erhalten, da die Tröpfchen im Bildfeld normalerweise kleiner und weniger zahlreich sind.ROIs mit Photonenzahlen über der Photonenakkumulationsgrenze (auf >500 Zählungen/Pixel eingestellt) wurden ebenfalls für die Analyse verworfen.Passen Sie die aus dem interessierenden Bereich erhaltene Intensitätsabfallkurve mit einer Intensität an, die zu Beginn der Lebensdauer bei 90 % des Maximums (etwas nach der maximalen Intensität des Abfalls) liegt, um eine minimale IRF-Interferenz sicherzustellen und gleichzeitig für den gesamten Intensitätsabfall das Gleiche beizubehalten Einstellungen Relatives Zeitfenster Es wurden 25 bis 50 ROI für Flöße und Spots und 15 bis 25 ROI für Tropfen analysiert, Bilder ausgewählt aus mehr als 4 Replikaten, die aus mindestens 3 unabhängigen Experimenten aufgezeichnet wurden.Zweiseitige t-Tests wurden verwendet, um statistische Unterschiede zwischen Arten oder zwischen Koazervatsystemen zu bewerten.Für eine pixelweise Analyse der Lebensdauer (τ) wurde die Gesamtdämpfung der Lebensdauer über das Feld für jeden Kanal berechnet und eine Näherung eines exponentiellen 2/3-Komponenten-Dämpfungsmodells durchgeführt.Die Lebensdauerdämpfung für jedes Pixel wurde dann mithilfe zuvor berechneter τ-Werte angepasst, was zu einem Pseudofarben-FLIM-Anpassungsbild führte.Der Tail-Fit-Lebensdauerbereich war bei allen Bildern desselben Kanals gleich und jeder Zerfall erzeugte genügend Photonen, um eine zuverlässige Anpassung zu ermöglichen.Für die FRET-Analyse wurden Pixel ausgewählt, indem ein niedrigerer Intensitätsschwellenwert von 100 Photonen angewendet wurde, was im Durchschnitt ein Hintergrundsignal (FBG) von 11 Photonen ergab.Die Fluoreszenzintensität jedes Kanals wurde durch experimentell ermittelte Korrekturfaktoren korrigiert: 69 spektrales Übersprechen α betrug 0,004, direkte Anregung β betrug 0,0305, Detektionseffizienz γ betrug 0,517.Die FRET-Effizienz auf Pixelebene wird dann anhand der folgenden Gleichung berechnet:
Dabei ist FDD die im Donorkanal (grün) beobachtete Fluoreszenzintensität, FDA die im Akzeptorkanal (rot) unter indirekter Anregung beobachtete Fluoreszenzintensität und FAA die im Akzeptorkanal (rot) unter direkter Anregung beobachtete Fluoreszenzintensität ( KUCHEN).Im Kanal werden Fluoreszenzintensitätsimpulse beobachtet.
Platzieren Sie 100 µl LLPS-Reaktionslösungen mit 25 µM unmarkiertem Monomer Tau441 (mit oder ohne 25 µM αS) in LLPS-Puffer (ergänzt wie oben) auf nicht bindenden 96-Well-Mikrotiterplatten mit Klebefolienbeschichtung und die Tröpfchenbildung wurde anschließend durch WF-Mikroskopie überprüft Gleichgewicht.innerhalb von 10 Min.Nach 48 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Vorhandensein von Proteinflößen und -flecken bestätigt.Entfernen Sie dann vorsichtig die Flüssigkeit über den Flößen aus den Vertiefungen, geben Sie dann 50 l Dissoziationspuffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) hinzu und inkubieren Sie 10 Minuten lang.Die hohe Salzkonzentration stellt sicher, dass sich LLPS aufgrund von PEG-Resten nicht wiederholt und mögliche Proteinanordnungen, die nur durch elektrostatische Wechselwirkungen gebildet werden, zerlegt werden.Anschließend wurde der Boden der Vertiefung vorsichtig mit einer Mikropipettenspitze abgekratzt und die resultierende Lösung in eine leere Beobachtungsvertiefung überführt.Nach einstündiger Inkubation der Proben mit 50 μM ThT wurde das Vorhandensein isolierter Flecken mittels WF-Mikroskopie überprüft.Bereiten Sie beschallte αS-Fibrillen vor, indem Sie 300 µl einer 70-µM αS-Lösung in PBS mit pH 7,4, Natriumazid 0,01 % bei 37 °C und 200 U/min auf einem Orbitalschüttler 7 Tage lang inkubieren.Die Lösung wurde dann 30 Minuten lang bei 9600 × g zentrifugiert, das Pellet wurde in PBS pH 7,4 resuspendiert und die Fibrillenproben wurden mit Ultraschall behandelt (1 Minute, 50 % Zyklus, 80 % Amplitude in einem Vibra-Cell VC130 Ultraschallgerät, Sonics, Newton, USA). mit einer relativ gleichmäßigen Größenverteilung kleiner Fibrillen.
Die FCS/FCCS-Analyse und die Zweifarbenkoinzidenzerkennung (TCCD) wurden mit demselben zeitaufgelösten konfokalen Fluoreszenzmikroskop MT200 (Pico-Quant, Berlin, Deutschland) durchgeführt, das für die FLIM-FRET-Mikroskopieexperimente im PIE-Modus verwendet wurde.Die Laserleistung für diese Experimente wurde auf 6,0 µW (481 nm) und 6,2 µW (637 nm) erhöht.Die Kombination dieser Laserleistungen wurde gewählt, um eine ähnliche Helligkeit für die verwendeten Fluorophorpaare zu erzeugen und gleichzeitig optimale Zählraten zu erreichen und Photobleichung und Sättigung zu vermeiden.Sowohl die Datenerfassung als auch die Analyse wurden mit der kommerziell erhältlichen Software SymphoTime64 Version 2.3 (PicoQuant, Berlin, Deutschland) durchgeführt.
Mit LLPS erhaltene Proben isolierter αS/Tau-Aggregate werden in Isolationspuffer auf die entsprechende monomolekulare Konzentration verdünnt (typischerweise eine 1:500-Verdünnung, da Aggregate bereits in niedrigen Konzentrationen vorliegen, wenn sie aus Koazervatproben isoliert werden).Die Proben wurden direkt auf Deckgläser (Corning, USA) aufgetragen, die mit einer BSA-Lösung in einer Konzentration von 1 mg/ml vorbeschichtet waren.
Für die PIE-smFRET-Analyse in den grünen und roten Kanälen wurde ein niedrigerer Intensitätsschwellenwert von 25 Photonen angewendet, um durch Monomerereignisse verursachte Signale geringer Intensität herauszufiltern (beachten Sie, dass Monomere zahlreicher aggregierte Proben im Vergleich zu isolierten Aggregaten sind).Dieser Schwellenwert wurde als das Fünffache der durchschnittlichen Intensität des Monomer-αS berechnet, das aus der Analyse reiner Monomerproben erhalten wurde, um gezielt Aggregate für die Analyse auszuwählen.Die PIE-Antriebsschaltung hat zusammen mit der TSCPC-Datenerfassung die Anwendung eines Lebensdauer-Gewichtungsfilters ermöglicht, der dabei hilft, Hintergrund- und spektrales Übersprechen zu eliminieren.Die mithilfe der oben genannten Schwellenwerte ausgewählte Flare-Intensität wurde mithilfe des durchschnittlichen Hintergrundsignals korrigiert, das aus den Histogrammen des Auftretens gegenüber der Intensität/Bin der Nur-Puffer-Proben ermittelt wurde.Mit großen Aggregaten verbundene Bursts belegen typischerweise mehrere aufeinanderfolgende Bins in der Zeitspur (auf 1 ms eingestellt).In diesen Fällen wurde ein Behälter mit maximaler Festigkeit gewählt.Für die FRET- und stöchiometrische Analyse wurde der theoretisch ermittelte Gammafaktor γ (0,517) verwendet.Spektrales Übersprechen und direkte Anregungsbeiträge sind bei der verwendeten Anregungslaserleistung vernachlässigbar (experimentell bestimmt).Die Effizienz und Stöchiometrie von FRET bei einer Explosion wird wie folgt berechnet.