Chemische Komponente aus Spiralrohr aus Edelstahl 347, Identifizierung neuartiger, auf Interferon reagierender Chaperonproteine ​​des humanen Leukozyten-Antigen-A (HLA-A) mittels vernetzter Massenspektrometrie (CLMS).

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Produktbeschreibung

Spulenrohre aus Edelstahl 347L, Stahlsorte: SS347L

Das Interferon-Signalsystem induziert eine starke Zytokinreaktion auf eine Vielzahl pathogener und intrinsischer pathologischer Signale aus der Umgebung, was zur Induktion von Untergruppen von Interferon-induzierbaren Proteinen führt.Wir verwendeten DSS-vermittelte Cross-Link-Massenspektrometrie (CLMS), um neue Protein-Protein-Wechselwirkungen im Bereich der Interferon-induzierten Proteine ​​zu erkennen.Zusätzlich zu den erwarteten Interferon-induzierbaren Proteinen identifizierten wir auch neuartige intermolekulare und intramolekulare vernetzte Addukte kanonischer Interferon-induzierbarer Proteine ​​wie MX1, USP18, OAS3 und STAT1.Wir konzentrierten uns auf die orthogonale Validierung eines neuartigen Satzes von Interferon-induzierbaren Proteinnetzwerken, die durch HLA-A-Proteine ​​(H2BFS-HLA-A-HMGA1) gebildet werden, mittels Co-Immunpräzipitation und deren weitere Untersuchung mittels molekulardynamischer Modellierung.Die Modellierung der Konformationsdynamik des Proteinkomplexes ergab mehrere Interaktionsstellen, die die in den CLMS-Ergebnissen identifizierten Interaktionen widerspiegelten.Gemeinsam präsentieren wir eine Pilotstudie zu CLMS zur Identifizierung neuer durch Interferon induzierter Signalkomplexe und freuen uns auf den breiteren Einsatz von CLMS zur Identifizierung neuer Dynamiken von Proteininteraktionen in der Tumormikroumgebung.
Bevor eine adaptive Immunantwort beginnt, löst das angeborene Abwehrsystem des Wirts eine antimikrobielle Reaktion aus, die durch eine Familie sezernierter alpha-helikaler Zytokine, sogenannte Interferone (IFNs), vermittelt wird.Die Typ-I-IFN-Klassen IFNα und IFNβ aktivieren zelluläre Reaktionen, einschließlich antiviraler, proapoptotischer, proinflammatorischer und antiproliferativer Zustände.Beim Menschen sind 13 Subtypen von IFNα bekannt, die alle auf Chromosom 91 geclustert sind. Überraschenderweise wurde nur IFNα2 für die klinische Verwendung untersucht.In letzter Zeit wurde besonderes Augenmerk auf die Erforschung anderer Subtypen von IFNα gelegt.Eine aktuelle Studie zeigte, dass IFNα14 im Vergleich zum kanonischen IFNα2-Subtyp eine der wirksamsten Isoformen bei der Einschränkung der HBV2- und HIV-13,4-Replikation ist.
Es wurde festgestellt, dass aktivierte Typ-I-Interferonrezeptorkomplexe (IFNAR1 und IFNAR2) eine Signaltransduktionskaskade auslösen, die durch die Januskinasen TYK2 und JAK15,6 vermittelt wird.Diese Januskinasen phosphorylieren Signalwandler und Transkriptionsproteinaktivatoren (STAT1 und STAT2) an Tyrosinresten, um die SH2-Domänen-vermittelte Heterodimerisierung zu initiieren6.Anschließend bindet IRF9 STAT-Heterodimere, um einen trimeren Komplex des IFN-stimulierten Faktor-3-Gens (ISGF3) zu bilden, der in den Zellkern transloziert und die Transkription von über 2000 Interferon-stimulierten Genen (ISGs) induziert5,6,7,8.
ISGs bilden das Rückgrat des angeborenen Immunsystems, insbesondere als Reaktion auf einen Virusangriff.Als erste Verteidigungslinie gegen Virusinfektionen nutzen Zellen schnell umfangreiche Wechselwirkungen zellulärer Proteine ​​mit einem breiten Spektrum biologischer Aktivitäten.Zu diesen Proteinen gehören Mustererkennungsrezeptoren, Signalmoleküle, Transkriptionsfaktoren und Proteine ​​mit direkter antiviraler Funktion sowie negative Regulatoren von Immunantworten9.Ein Großteil der Informationen zur ISG-Aktivität stammt aus funktionellen Screens unter Verwendung von Überexpressions-Screens10,11 oder Gen-Silencing-Techniken (siRNA, RNAi und CRISPR)12,13, bei denen einzelne ISGs exprimiert oder gehemmt werden und ihre Aktivität an verschiedenen Viren getestet wird.Obwohl diese Studien die antiviralen Eigenschaften einzelner ISGs ermittelt haben, sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der einzelnen ISGs noch weitgehend unbekannt.Es ist allgemein anerkannt, dass viele Proteine ​​mit einem oder mehreren Zytokinen interagieren, um die volle Aktivität sicherzustellen. Daher interagieren ISGs entweder direkt oder ihre Interaktionen werden durch zelluläre Proteine ​​vermittelt.Beispielsweise wurde in einer kürzlich durchgeführten photovernetzten Proteomikstudie ATPase VCP/p97 als wichtiger IFITM3-Interaktionspartner identifiziert, dessen Hemmung zu Defekten bei der lysosomalen Sortierung, dem Umsatz und dem Cotransport von IFITM3 mit viralen Partikeln führt 14 .Mittels Immunpräzipitation identifizierten wir VAPA, ein Vesikel-assoziiertes Protein, als Interaktionspartner mit IFITM1/2/3, der die cholesterinvermittelte Virusreifung vermittelt, und dies wurde durch eine weitere Studie mit einem Hefe-Zwei-Hybrid-System bestätigt.Wissenschaftliche Unterstützung 15, 16.
Ein grundlegender biologischer Prozess, der an der Unterdrückung von Infektionen und malignen Transformationen beteiligt ist, ist die Antigenpräsentation, die durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) vermittelt wird.Peptide (8–12 Aminosäuren lang) aus gespaltenen, vorzeitig beendeten oder fehlgefalteten Proteinen werden in das MHC-I-Heterodimer geladen (bestehend aus schweren und leichten MHC-I-Ketten, genannt β-2-Mikroglobulin; β2M) 17,18 .Die resultierenden stabilen MHC-I-Trimere werden zur Zelloberfläche transportiert, wo sie CD8+ T-Zellen (zytotoxische T-Zellen) intrazelluläre Peptide präsentieren17.T-Zellen erkennen und zerstören diese Krankheitserreger und Zellen, die ein tumorspezifisches Antigen tragen.Folglich unterdrücken Krankheitserreger und Tumorzellen häufig den Prozess der Antigenpräsentation, um einer Immunüberwachung zu entgehen.Darüber hinaus ist MHC-I in 40–90 % der menschlichen Tumoren herunterreguliert, was häufig mit einer schlechteren Prognose verbunden ist19.
Gene, die an der Reaktion auf Krankheitserreger beteiligt sind, müssen schnell zwischen einem Ruhezustand und einem Zustand aktiver Transkription wechseln.Daher wird angenommen, dass mehrere zelluläre Proteine ​​an der Reaktion auf einen hohen IFN-Bedarf über kurze Zeiträume beteiligt sind, einschließlich der Umgestaltung und Modifikation des Promotorchromatins 20,21.Die meisten Studien konzentrierten sich auf die Identifizierung einzelner ISG-Proteinpartner in Gegenwart von IFN.Mehrere proteomische und transkriptomische Studien an Modellzellsystemen haben die Wirkung von IFN auf die Zelllandschaft aufgeklärt.Trotz eines wachsenden Verständnisses der durch Interferone hervorgerufenen Dynamik wissen wir jedoch immer noch wenig über die Beteiligung von ISGs.Bei der Betrachtung der Komplexität und zeitabhängigen Dynamik der Interferon-Signalübertragung stellen sich zwei Fragen: (i) ist es möglich, die an der schnellen Signalübertragung beteiligten Multiproteinkomplexe zu stabilisieren und einzufangen, und (ii) können diese Wechselwirkungen im 3D-Raum abgebildet werden?
Um diese Probleme anzugehen, haben wir eine durch Disuccinimid-Suberat vermittelte chemische Vernetzung (DSS) in Verbindung mit Massenspektrometrie (CLMS) implementiert, um das IFNα-induzierte Proteininteraktionsnetzwerk und seine Dynamik zu untersuchen.DSS fügt in vivo kovalente Bindungen zwischen proximalen Resten von Proteinen und/oder Proteinkomplexen hinzu.Die anschließende MS-Analyse deckt spezifische Vernetzungsstellen auf, die die räumliche Nähe von Regionen innerhalb eines bestimmten Proteins, sogenannte interne Verknüpfungen, oder Untereinheiten in Proteinkomplexen, sogenannte Wechselbeziehungen, widerspiegeln.Mit diesem Ansatz haben wir mehrere neue Protein-Protein-Komplexe sowie Interferon-induzierte Multiprotein-Interaktionsnetzwerke identifiziert.Durch weitere Tests einer Teilmenge dieser neuen Interaktionen zeigen wir, dass H2BFS (H2B-Histon-Typ-FS; im Folgenden als H2B bezeichnet) und MDN1 als Bindungspartner für HLA-A fungieren.
Flo-1-Zellen sind eines der bekanntesten In-vitro-Modelle für Adenokarzinome der Speiseröhre, da sie wichtige Merkmale von Tumoren der Speiseröhre nachahmen22,23.Allerdings sind nicht alle Tumoren immunogen und um festzustellen, ob Flo-1-Zellen auf die Interferonbehandlung ansprechen, haben wir Flo-1-Zellen 72 Stunden lang mit 10 ng/ml IFNα behandelt.Flo-1-Zellen zeigten eine frühe Induktion von pSTAT1 und IRF1, die 2 Stunden nach der Behandlung begann und 72 Stunden anhielt, mit einer zeitabhängigen Abnahme der stationären IRF1-Spiegel (Abbildung 1A).Es wurde festgestellt, dass ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2 und ISG15) nach 6 Stunden stark induziert wurden und die klassischen Reaktionen der mittleren und späten Phase auf IFNα nachahmen (Abbildung 1A).Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass dieses Zellmodell zur Untersuchung von Interferonreaktionen verwendet werden kann.
Differenzielle Proteinexpressionsreaktionen in Flo-1-Zellen nach IFNα-Behandlung.(A) Die Proteinexpression in Flo-1-Zellen, die 2, 6, 24, 48 und 72 Stunden lang mit 10 ng/ml IFNα behandelt wurden, wurde durch Immunoblot unter Verwendung der angegebenen ISG-Antikörper analysiert.(B) Mit Coomassie-Blau gefärbte SDS-PAGE-Gele ganzer Zellextrakte nach Vernetzung mit DSS für die angegebenen Zeiten und Konzentrationen.(C) Repräsentativer Immunblot, der mit p53(DO-1)-Antikörper aus denselben Proben untersucht wurde, um den Grad der Proteinvernetzung zu beurteilen.
Um die In-situ-Proteininteraktionslandschaft zu erfassen, verwendeten wir DSS, ein aufgrund seiner hohen Membranpermeabilität und relativ kurzen Reaktionszeit weit verbreitetes Vernetzungsmittel.Die kürzere Reaktionszeit trägt dazu bei, die Bildung großer Aggregate vernetzter Proteine ​​zu verhindern und dadurch die Stabilität des Vernetzers aufrechtzuerhalten.Um die optimale DSS-Konzentration zu bestimmen und eine Übervernetzung zu vermeiden, setzten wir die Zellen zunächst 5, 10, 5 bzw. 30 Minuten lang 5, 2,5 und 1 mM DSS aus und analysierten die Lysate durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE (Daten nicht angezeigt) .Zelllysate scheinen bei der niedrigsten Konzentration und zum kürzesten Zeitpunkt stark vernetzt zu sein.Daher wurde DSS über 5 Minuten auf 1, 0,5 und 0,1 mM titriert (Abbildung 1B).Eine optimale Vernetzung wurde mit 0,5 mM DSS für 5 Minuten beobachtet, und diese Bedingungen wurden für mit IFNα behandelte Zellen gewählt.Darüber hinaus zeigt Abbildung 1C einen Western Blot, der mit dem Antikörper p53 (DO-1) durchgeführt wurde, um den Grad der Proteinvernetzung zu beurteilen.
Flo-1-Zellen wurden vor der Zugabe des Vernetzers 24 Stunden lang mit 10 ng/ml IFNα behandelt.Vernetzte Zellen wurden anschließend durch zweistufige Proteolyse lysiert und Proteine ​​​​durch FASP verarbeitet (Abb. 2)24,25.Vernetzte tryptische Peptide wurden massenspektrometrisch analysiert (Abb. 2).Die MS/MS-Spektren werden dann mit der Proteinsequenz abgeglichen und mit MaxQuant26,27 quantifiziert.Vernetzte Peptide wurden aus den erhaltenen Spektren mit dem SIM-XL-Programm identifiziert und einzelne Verbindungen wurden mit den Open-Source-Computing-Software-Pipelines xQuest28 und SIM-XL29 zu einem komplexen Netzwerk kombiniert (Abb. 2).SIM-XL identifiziert Protein-Protein-Wechselwirkungen, interne Ketten und einzelne Ketten in einfachen oder komplexen Proteinmischungen und stellt Skripte zur Visualisierung von Wechselwirkungen in Proteinstrukturen bereit.Darüber hinaus wird jeder Querverweis als ID-Score entsprechend der Qualität des MS/MS29-Spektrums eingestuft.Mehrere hochzuverlässige Protein-Protein-Wechselwirkungen und -Komplexe wurden identifiziert, und eine neue Reihe von Wechselwirkungen wurde mithilfe von Co-Immunpräzipitation und Konformationsänderungen von Komplexen mithilfe von Molekulardynamikmodellen (MD) weiter untersucht (Abb. 2) 30, 31.
Schematischer Überblick über die CLMS-Methode.Flo-1-Zellen wurden 24 Stunden lang mit 10 ng/ml IFNα behandelt, gefolgt von einer In-situ-Proteinvernetzung mittels DSS, gefolgt von Zelllyse und Trypsinisierung.Vernetzte Proben wurden mit einem Orbitrap-Massenspektrometer analysiert und während der LC-MS/MS weiter auf Fragmentierung von Peptidvorläufern untersucht.Aus den erhaltenen Spektren wurden mithilfe des Programms Spectrum Recognition Machine of the Crosslinked Peptides (SIM-XL) zwei verknüpfte Peptide identifiziert und alle Verbindungen mithilfe von Rechenpipelines zu einem komplexen Netzwerk kombiniert.Filtern Sie Interaktionen mit geringer Konfidenz basierend auf FDR-Werten (Falsch-Positiv-Rate) heraus.Mehrere neue hochpräzise Protein-Protein-Wechselwirkungen wurden außerdem durch Co-Immunpräzipitation bestätigt und Konformationsänderungen in den Komplexen wurden mithilfe von Molekulardynamikmodellen (MD) untersucht.
Mit MaxQuant wurden in unstimulierten bzw. stimulierten IFNα-Proben insgesamt ca. 30.500 bzw. ca. 28.500 Peptide nachgewiesen (Ergänzungstabelle S1, Abb. 3A).Die Peptidlängenverteilung zeigte in beiden Fällen einen höheren Anteil größerer Peptide, was auf das Vorhandensein vernetzter Peptide hinweist (Abb. 3B, C).Darüber hinaus war in IFNα-behandelten Proben ein größerer Anteil größerer Peptide im Bereich 40–55 vorhanden (Abb. 3C).Die Proteinkartierung gegen die log2-Intensität zeigte, dass klassische Interferon-stimulierte Proteine ​​im Vergleich zu unbehandelten Proben am häufigsten vorkamen, einschließlich MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 und HLA-F (Abbildung 3D).Die Analyse der Wege für Proteine, die als Reaktion auf die IFNα-Behandlung um mehr als das Dreifache angereichert waren, unter Verwendung der Reactome-Wegdatenbank zeigte, dass die MHC-I-vermittelte Antigenpräsentation und -verarbeitung der dominante Weg war (Abbildung 3E).In Übereinstimmung mit früheren Berichten gehörten zu den aktivierten Signalwegen antivirale Reaktionen, die durch OAS und ISG15 sowie IFNα/β und Zytokinsignale vermittelt werden.Darüber hinaus wurden Lysin- und Serin-spezifische Proteinvernetzungen anhand der ursprünglich erfassten MS/MS-Spektren mithilfe von SIM-XL identifiziert.Eine aktuelle Studie berichtete über 104 ISGs, die 20 Viren aus 9 Virusklassen umfassen, und zwar durch Metaanalyse einzelner ISG-Überexpressionsstudien in 5 Zelltypen9.Um jedoch die rechnerischen Einschränkungen beim Screening großer Datensätze zu überwinden, haben wir mit einem kleineren Datensatz begonnen, um mögliche Wechselwirkungen zwischen der Liste der von Padaria et al. gemeldeten IRDS-Gene zu untersuchen, bei denen es sich bei den meisten um ISGs handelt.
Identifizierung unterschiedlich exprimierter vernetzter Proteine ​​als Reaktion auf IFNα (Daten erhalten von MaxQuant).(A) Venn-Diagramm, das die Anzahl der gemeinsamen und exklusiven Peptide darstellt, die in mit IFNα14 behandelten und unbehandelten Flo-1-Proben identifiziert wurden.Peptidlängenverteilung unbehandelter (B) und IFNα-behandelter (C) vernetzter Proben.(D) Wärmekarte, die log2 (LFQ-Intensität) zwischen unbehandelten und IFNα14-behandelten Flo-1-Zellen darstellt.Das linke Feld zeigt die Proteine, die in Gegenwart von IFNα am aktivsten aktiviert werden.(E) Histogramm, das die 20 wichtigsten Anreicherungswege nach IFNα-Behandlung darstellt.Die Reactome-Pathway-Datenbank analysierte mehr als vierfache Veränderungen in hochregulierten IFNα-responsiven Proteinen.
Die Interferon-vermittelte ISG-Stimulation ist gut dokumentiert, aber auf molekularer Ebene ist kaum bekannt, wie diese Proteine ​​​​zu einer Vielzahl biologischer Funktionen führen.Wir untersuchten Proteininteraktionen mit einem hohen Maß an Vertrauen zwischen bekannten ISGs.Interessanterweise haben wir ein Netzwerk identifiziert, das MX1-, USP18-, ROBO1-, OAS3- und STAT1-Proteine ​​umfasst, die als Reaktion auf die IFNα-Behandlung einen großen Komplex bilden (Abbildung 4, Tabelle S2) 32,33,34.Am wichtigsten ist, dass diese Wechselwirkungen in allen mit IFNα behandelten Dreifachproben und nicht in unbehandelten Proben gefunden wurden, was darauf hindeutet, dass sie speziell als Reaktion auf die IFNα-Behandlung gebildet wurden.Es ist bekannt, dass STAT1 die Expression dieser ISGs transkriptionell reguliert, seine Interaktion mit ISGs auf Proteinebene wurde jedoch nicht untersucht.Die Kristallstruktur von STAT1 zeigte, dass seine helikale Domäne (CCD) nicht an der Wechselwirkung mit DNA oder Protomeren während der Bildung von Dimeren beteiligt ist35.Diese α-Helices bilden eine helikale Helixstruktur, die eine überwiegend hydrophile Oberfläche für das Auftreten von Wechselwirkungen bietet 35 .In unseren CLMS-Daten haben wir beobachtet, dass die meisten Interaktionen mit STAT1 in der SH2-Domäne vor dem CCD, der Linkerdomäne oder dem C-terminalen Schwanz (Reste 700–708) auftraten (Abbildung 4A).In einer früheren Studie wurde berichtet, dass USP18 an die CCD- und DNA-Bindungsdomäne (DBD) von STAT2 bindet und an die Untereinheit des Typ-I-Interferonrezeptors IFNAR2 rekrutiert wird, um die Hemmung der Typ-I-Interferonsignalisierung zu vermitteln 24 .Unsere Daten zeigten auch, dass die katalytische Domäne von USP18 mit STAT1 DBD interagiert (Abbildung 4A,D), was darauf hindeutet, dass sowohl STAT1 als auch STAT2 eine Rolle bei der Anziehung von USP18 zu IFNAR2 spielen könnten.
Protein-Protein-ISG-Netzwerk, identifiziert in vernetzten Zellen, die mit IFNα behandelt wurden.(A) 2D-Interaktionsdiagramm, das Protein-Protein-Wechselwirkungen zeigt (erzeugt im SIM-XL-Programm), wobei die Linien intermolekulare Wechselwirkungen darstellen (Vernetzungsgrenzwert auf 3,5 eingestellt).Domänen unterschiedlicher Identität werden durch ihre Farbe32 gekennzeichnet: MX1-Domäne, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) und GED (569–660).OAS3-Domänen: OAS1_C (160–344), OAS1_C (559–745), NTP_transf_2 (780–872) und OAS1_C (903–108).Domäne ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) und Fn3 (777–864).STAT1-Felder: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) und STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Kreisförmiger Viewer vernetzter Proteine ​​(MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 und STAT1) mit blau bzw. rot markierten Interaktionen und Interaktionen.Der Vernetzungsschwellenwert wurde auf 3,5 festgelegt.Punktdiagramme zeigen STAT1-Interaktionsstellen mit MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) und OAS3 (F) sowie K- oder S-Interaktionsstellen zwischen den beiden Peptiden.In der Abbildung ist der Cross-Link-Score-Schwellenwert auf 3,0 eingestellt.(G) Verschiedene Interaktionsstellen zwischen STAT1- und OAS3-DI-Domänen, überlagert mit ihren Proteinstrukturen in PyMol (PyMOL-Molekulargrafiksystem, Version 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (PDB-ID: 1bf533) und OAS3 (PDB-ID: 4s3n34).) Programm.
Beim Menschen wurden zwei Isoformen von USP18 beschrieben, ein Protein voller Länge, das überwiegend im Zellkern lokalisiert ist, und eine Isoform ohne N-terminale Domäne, USP18-sf, die gleichmäßig im Zytoplasma und Zellkern verteilt ist 36 .Darüber hinaus wurde vorhergesagt, dass der N-Terminus unstrukturiert ist und keine Isopeptidaseaktivität oder ISG1537-Bindung erfordert.Die meisten der in unserer Studie identifizierten Wechselwirkungen befanden sich am N-Terminus des Proteins, was darauf hindeutet, dass diese Wechselwirkungen USP18 voller Länge betreffen (Abbildung 4A,D) und daher wahrscheinlich im Zellkern auftreten.Darüber hinaus deuten unsere Daten auch darauf hin, dass der N-Terminus auf Protein-zu-Protein-Wechselwirkungen spezialisiert ist.Die IFNAR2-Bindungsstelle befindet sich zwischen den Resten 312–368 und bemerkenswerterweise bindet keines der Proteine ​​im Komplex an diese Region (Abb. 4A) 37,38 .Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die IFNAR2-Bindungsdomäne ausschließlich vom Rezeptorprotein verwendet wird.Darüber hinaus wurde festgestellt, dass nur OAS3 und ROBO1 mit Domänen oberhalb des N-Terminus und der IFNAR2-Bindungsstelle assoziiert sind (Abbildung 4A).
ROBO1 gehört zur Immunglobulin (Ig)-Superfamilie der Transmembran-Signalmoleküle und besteht aus fünf Ig-Domänen und drei Fibronektin (Fn)-Domänen im extrazellulären Bereich.Auf diese extrazellulären Domänen folgen eine membrannahe Region und eine einzelne Transmembranhelix 39. Eine unstrukturierte intrazelluläre Region befindet sich am C-Terminus und enthält konservierte Sequenzmotive, die die Effektorproteinbindung vermitteln39.Der Bereich zwischen den Aminosäuren ~1100 und 1600 ist größtenteils ungeordnet.Wir fanden heraus, dass MX1 über Ig-, Fn- und intrazelluläre Domänen mit ROBO1 interagiert, während die meisten Interaktionen mit STAT1 zwischen seinem CCD, der Linkerdomäne und dem C-Terminus von ROBO1 stattfinden (Abb. 4A, E).Andererseits waren Interaktionen mit DI-, DIII- und OAS3-Linkerregionen über das gesamte ROBO1-Protein verteilt (Abb. 4A).
Die Proteinfamilie der Oligoadenylatsynthase (OAS) akzeptiert und bindet intrazelluläre doppelsträngige RNA (dsRNA), unterliegt Konformationsänderungen und synthetisiert 2′,5′-verknüpfte Oligoadenylate (2-5 As) 40 .Es wurde festgestellt, dass OAS3 von den drei OASs die höchste Affinität für dsRNA aufweist und die geringste Menge an 2-5 As synthetisiert, die RNase L aktivieren und dadurch die Virusreplikation begrenzen können 41 .Die OAS-Familie besteht aus Polymerase-beta (pol-β)-ähnlichen Nukleotidtransferasedomänen.Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass die katalytische Aktivität der C-terminalen Domäne (DIII) von der dsRNA-bindenden Domäne (DI) abhängt, die für die Aktivierung von OAS342 erforderlich ist.Wir beobachteten, dass die DI- und DII-Domänen von OAS3 mit CCD und einer kleinen Verbindungsregion zwischen SH2 und STAT1 TAD interagieren (Abbildung 4A,F).Die Überlagerung verschiedener Vernetzungsstellen auf der Proteinstruktur ergab eine Wechselwirkung zwischen dem β-Faltblatt und der DBD-STAT1-Schleife und einer offenen Tasche oder einem Hohlraum, der durch die Reste 60–75 in der DI-Domäne von OAS3 gebildet wird (Abb. 4G).Die Ausrichtung der Proteine ​​im Komplex zeigte auch, dass keine der Wechselwirkungen mit OAS3 die DNA-Bindungsfähigkeit seiner DI-Domäne beeinträchtigte (Abb. S1A).Darüber hinaus interagiert die N-terminale Domäne von GTPase MX1 intensiv mit den DI- und DIII-Domänen von OAS3 (Abb. 4A).Wir beobachteten auch eine Wechselwirkung zwischen OAS1 und MX1 in allen drei IFNα-behandelten Wiederholungen, wobei eine einzelne OAS1-Domäne (ebenfalls katalytisch aktiv) mit allen drei MX1-Domänen interagierte (Abbildung S2A,B).
MX-Proteine ​​gehören zu einer großen Familie von Dynein-ähnlichen GTPasen, die eine N-terminale GTPase-Domäne enthalten, die GTP bindet und hydrolysiert, eine Zwischendomäne, die die Selbstorganisation vermittelt, und einen C-terminalen Leucin-Zipper, der als GTPase fungiert (LZ). ).Domäne Effektordomäne25,43.MX1 bindet an Untereinheiten viraler Polymerasen, um die Transkription des viralen Gens zu blockieren43.Ein zuvor berichtetes Hefe-Zwei-Hybrid-Screening zeigte, dass PIAS1-assoziiertes MX1 die STAT1-vermittelte Genaktivierung durch Blockierung der DNA-Bindungsaktivität hemmt und auch SUMO E344,45-Ligaseaktivität aufweist.Hier zeigen wir, dass MX1 an STAT1 bindet (Abbildung 4C,D). Wie sich diese Interaktion jedoch auf die STAT1-vermittelte Genaktivierung als Reaktion auf IFNα auswirkt, muss weiter untersucht werden.Darüber hinaus fanden wir auch heraus, dass MX1 in allen drei IFNα-behandelten Wiederholungen mit IFIT3 und DDX60 interagierte (Abb. S2C).
DDX60 ist eine IFN-induzierte zytoplasmatische Helikase, von der bereits berichtet wurde, dass sie eine Rolle beim RIG-I-unabhängigen Abbau viraler RNA46 spielt.Es interagiert mit RIG-I und aktiviert dessen Signalübertragung auf ligandenspezifische Weise 46. DDX60 besteht aus einer DEXD/H-Box-Helikasedomäne und einer C-terminalen Helikasedomäne, die virale RNA und DNA binden47.Die meisten seiner Wechselwirkungen mit MX1 und IFIT3 finden in langen N- und C-terminalen Regionen ohne kanonische Domänen oder Motive statt (Abb. S2E, F).MX1 ist jedoch auch mit der DEXD/H-Box-Helikasedomäne assoziiert (Abb. S2E).Proteine ​​der IFIT-Familie verfügen über Tandemkopien eines charakteristischen Helix-Turn-Helix-Motivs, das als Tetrapeptid-Wiederholung (TPR) bezeichnet wird.Es wurde festgestellt, dass IFIT3 ein positiver Modulator der RIG-I-Signalübertragung und daher eine Komponente des MAVS-Komplexes ist.Zusammengenommen legen unsere Daten nahe, dass IFIT3 und DDX60 hauptsächlich in der Region zwischen TPR 3–6 von IFIT3 interagieren und möglicherweise eine Rolle bei der RIG-I/MAVS-Signalübertragung spielen (Abb. S2F).
Da das Screening des gesamten Proteoms rechenintensiv ist, haben wir anschließend die gesamte menschliche UniProt-Datenbank auf das Vorhandensein einer der IFNα-behandelten Wiederholungen überprüft.In dieser Replik fanden wir mehrere äußerst zuverlässige Interaktionsnetzwerke für HLA-A.Die Analyse der durch MS/MS-Spektren identifizierten Proteinwege zeigte, dass die MHC-I-basierte Antigenverarbeitung und -präsentation der durch Interferon induzierte Hauptweg ist (Abb. 3D).Daher haben wir uns darauf konzentriert, die Proteininteraktionen von MHC-I-Molekülen mit einem hohen Maß an Sicherheit in allen vernetzten Proben zu untersuchen.HLA besteht aus α1-, α2- und α3-Domänen und leichten Ketten, und Mikroglobulin β2 (β2m) ist ein konstantes Chaperonprotein49.Sobald HLA im endoplasmatischen Retikulum zusammengesetzt ist, ist es in Abwesenheit von Peptidliganden instabil50.Die Peptidbindungsfurche wird durch die hochpolymorphen und unstrukturierten α1- und α2-Domänen in Nichtpeptidform und die relativ weniger polymorphe α351-Domäne gebildet.In Gegenwart von IFNα konnten wir zwei HLA-A-Komplexe nachweisen: einer interagiert mit HMGA1 und H2B (Abbildung 5, Tabelle S3) und der andere interagiert mit MDN1, LRCH4 und H2B (Abbildung 6).
IFNα induziert ein HLA-A-Interaktionsnetzwerk mit H2B (H2BFS) und HMGA1.(A) 2D-Diagramm (erstellt in der SIM-XL-Software), das verschiedene Arten von Interaktionen im H2B-HLA-A-HMGA1-Komplex darstellt: Interlink (blau), Interlink (rot) und Single Link (schwarz)..Domänen unterschiedlicher Identität sind farblich gekennzeichnet32: H2B (Histon; 2–102) und MHC-I (MHC_1; 25–203, Gruppe C1; 210–290 und MHC_I_C; 337–364).Der Vernetzungsschwellenwert wurde auf 3,5 festgelegt.Punktdiagramme zeigen HLA-A-Interaktionsstellen mit H2B (B) und HMGA1 (C) sowie K- oder S-Interaktionsstellen zwischen den beiden Peptiden.In der Abbildung ist der Cross-Link-Score-Schwellenwert auf 3,0 eingestellt.(D) Beziehungen zwischen Proteinen, die in den Strukturen der H2B-, HLA-A- und HMGA1-Proteine ​​im PyMOL-Programm gezeigt werden.Diese Strukturen wurden mit dem Phyre2-Server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) modelliert und die Vorlagenstrukturen für die Proteine ​​H2B, HLA-A und HMGA1 waren 1kx552, 1kj349 bzw. 2eze55.
IFNα induziert ein HLA-A-Interaktionsnetzwerk mit H2B (H2BFS), MDN1 und LRCH4.(A) Intramolekulare (rot) und intermolekulare (blau) Vernetzungen, dargestellt auf einer interaktiven 2D-Karte (erstellt in der SIM-XL-Software), wobei MDN1 als Kreis dargestellt ist.Der Vernetzungsschwellenwert wurde auf 3,5 festgelegt.Domänen unterschiedlicher Identität sind farblich gekennzeichnet32: H2B (Histon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, Gruppe C1; 210–290 und MHC_I_C; 337–364) und LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) und CH (535–641)).(B) Beziehungen zwischen Proteinen, die in den Strukturen der Proteine ​​H2B, HLA-A, LRCH4 und MDN1 im PyMOL-Programm gezeigt werden.Diese Strukturen wurden unter Verwendung des Phyre2-Servers (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) mit den Vorlagenstrukturen 1kx552, 1kj349, 6hlu62 und 6i2665 für die Proteine ​​H2B, HLA-A, LRCH4 und MDN1 modelliert. jeweils.Punktdiagramme, die K- oder S-Interaktionsstellen für HLA-A mit H2B (C), LRCH4 (D) und MDN1 (E) zeigen.Für Parzellen wurde der Cross-Link-Score-Schwellenwert auf 3,0 festgelegt.
Neben der Aufrechterhaltung der Integrität des Genoms ist Histon H2B auch an der Regulierung der Transkription beteiligt.Das H2B-Protein besteht aus einer zentralen Histondomäne (HFD), die aus drei durch Schleifen getrennten α-Helices und einem C-terminalen Schwanz besteht 41,52.Der größte Teil der Wechselwirkung mit H2B findet in der α1-Helix statt, die eine Trimerisierung mit dem HFD-Heterodimer ermöglicht (Abb. 5A, B).Obwohl Lysine an der DNA-Bindung beteiligt sind, sind einige Lysine auch alternative Acetylierungs- oder Methylierungsstellen.Beispielsweise sind die Reste K43, K46 und K57 von H2B nicht an der direkten DNA-Bindung beteiligt, sondern Ziele verschiedener posttranskriptioneller Modifikationen53.In ähnlicher Weise könnten die Reste K44, K47 und K57 in H2B in Gegenwart von IFNα eine alternative Rolle spielen, einschließlich Wechselwirkungen mit anderen Proteinen (Abb. 5A, B).Darüber hinaus aktiviert das extrachromosomale Histon H2B die Immunantwort in verschiedenen Zelltypen und fungiert als zytosolischer Sensor zum Nachweis doppelsträngiger DNA-Fragmente (dsDNA), die von Infektionserregern oder beschädigten Zellen stammen54.In Gegenwart von DNA-Viren hemmte die H2B-Depletion die IFN-β-Produktion und die STAT154-Phosphorylierung.Es ist auch bekannt, dass sich H2B schneller in den Zellkern hinein und aus diesem heraus bewegt als andere Kernhistone54.H2B-Wechselwirkungen mit MDN1 und LRCH4 wurden auch in ausgewählten unbehandelten Proben beobachtet.Wir fanden heraus, dass HLA-A in allen drei mit IFNα behandelten Proben und in einer unbehandelten Wiederholungsprobe mit H2B interagierte.Diese Daten spiegeln die Rolle von H2B in einer alternativen physiologischen Funktion wider, die von der Transkriptionsregulation unabhängig ist.
HMGA1 (High Mobility Group AT-Hook 1), ein kleines Nukleoprotein, das reich an krankheitsfördernden Aminosäuren ist, wurde in Verbindung mit HLA-A identifiziert.Es hat einen sauren C-terminalen Schwanz und drei verschiedene DBDs, die AT-Haken genannt werden, weil sie an die kleine Furche der AT-reichen Region in dsDNA55,56 binden.Diese Bindung bewirkt, dass sich die DNA biegt oder gerade richtet, wodurch kanonische Transkriptionsfaktoren auf ihre Konsensussequenz zugreifen können.Es wird angenommen, dass der C-terminale Schwanz an Protein-Protein-Wechselwirkungen und der Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren beteiligt ist, da C-terminale Deletionsmutanten nicht in der Lage sind, die Transkription zu initiieren57.Darüber hinaus enthält diese Domäne mehrere konservierte Phosphorylierungsstellen, die bekannte Substrate für Kinasen sind 58 .Wir beobachteten HLA-A- und H2B-Wechselwirkungen mit HMGA1 außerhalb der C-terminalen Domäne, was darauf hindeutet, dass die C-terminale Domäne hauptsächlich für die Transkriptionsfaktorbindung verwendet wird (Abb. 5A, C).HMGA-Proteine ​​konkurrieren mit Histon H1 um die Bindung an Adapter-DNA und erhöhen so die Zugänglichkeit57.Ebenso ist es wahrscheinlich, dass HMGA mit Histon H2B entlang der Linker-DNA in Konkurrenz zu Histon H1 interagiert.HMGB1 induziert die Expression von HLA-A, -B und -C in dendritischen Zellen und führt zu deren Aktivierung59, eine Wechselwirkung zwischen HMG und HLA wurde jedoch bisher nicht berichtet.Wir fanden heraus, dass HMGA1 mit den α1- und α3-Domänen von HLA-A interagiert, wobei die meisten Interaktionen außerhalb seiner 3 DBD stattfinden (Abbildung 5A,C).In unseren Händen wurde festgestellt, dass HLA-A im Zellkern lokalisiert ist (Daten nicht gezeigt), und da H2B und HMGA1 auch im Zellkern vorhanden sind, findet diese Wechselwirkung wahrscheinlich im Zellkern statt.Spezifische Addukte, die zwischen H2B, HLA-A und HMGA1 gemessen wurden, sind in Abbildung 5D dargestellt.
Die meisten Wechselwirkungen von HLA-A mit anderen Proteinen finden innerhalb seiner α1- und α2-Domänen und der ungeordneten C-terminalen Domäne statt (Abb. 6).In einem dieser Beispiele fanden wir heraus, dass HLA-A mit dem ungeordneten N-terminalen Schwanz von LRCH4 interagiert (Abbildung 6A,D).LRCH4 reguliert die TLR4-Aktivierung und die LPS-Zytokin-Induktion und moduliert dadurch die angeborene Immunantwort60,61.Es handelt sich um ein Membranprotein mit neun Leucin-reichen Wiederholungen (LRRs) und einem Calmodulin (CH)-Homologiemotiv in seiner Ektodomäne, gefolgt von einer Transmembrandomäne (TMD) 60, 62.Es wurde berichtet, dass CH-Domänen Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln 60 .Ein Abschnitt von etwa 300 Aminosäuren zwischen den LRR- und CH-Domänen ist relativ zugänglich, aber ungeordnet.Basierend auf der Funktion ungeordneter Regionen als Vermittler von Protein-Protein-Netzwerken und vesikulärem Transport 63 fanden wir heraus, dass die meisten Proteininteraktionen in ungeordneten Regionen stattfinden.Interaktionen mit MDN1 waren über die gesamte Länge des Proteins verteilt, einschließlich der LRR1-, LRR6-, CH-Domänen und Zufallsregionen, während H2B hauptsächlich an die CH-Domäne band (Abb. 6A, B).Bemerkenswerterweise betraf keine der Interaktionen das Kiefergelenk, was auf die Spezifität des CLMS-Ansatzes schließen lässt (Abbildung 6A, B).
MDN1 wurde auch als Teil des HLA-A-Proteinnetzwerks identifiziert (Abbildung 6A).Es gehört zur AAA-Proteinfamilie (ATPasen, die mit unterschiedlichen Aktivitäten assoziiert sind).Dabei handelt es sich um dieselbe N-terminale AAA-Domäne, die sich in einem hexameren Ring organisiert und den Assemblierungsfaktor aus der ribosomalen Untereinheit 60S 64 entfernt.scheint dynein64,65,66 ähnlich zu sein.Darüber hinaus folgt auf die Asp/Glu-reiche Region die MIDAS-Domäne (Metal Ion Dependent Site).Aufgrund der großen Größe von MDN1 (ungefähr 5600 Aminosäuren) und seiner begrenzten Homologie mit gut untersuchten Proteinen ist wenig über seine Struktur und Funktion beim Menschen bekannt.Wir identifizierten HLA-A, H2B und LRCH4 als MDN1-Bindungspartner und zeigten ihre Orientierung als Proteinkomplexe in PyMol (Abb. 6A, B).Diese drei Proteine ​​interagieren mit der AAA-Domäne, der Dynein-ähnlichen Linkerdomäne und möglicherweise der MIDAS MDN1-Domäne.In einem früheren Bericht wurde MDN1 durch Affinitätsreinigung von Köderproteinen als ein mit dem Histon H2B67 assoziiertes Protein identifiziert.Darüber hinaus berichtete eine aktuelle Studie auch über eine Wechselwirkung zwischen MDN und HLA-B in HCT116-Zellen mittels affinitätsgereinigter Massenspektrometrie, was unsere Ergebnisse stützt68.Die Identifizierung dieses Komplexes in IFNα-behandelten Proben legt nahe, dass MDN1 eine Rolle bei der Interferonsignalisierung spielt.
Da HLA-Gene stark polymorph sind, extrahierten wir Sequenzierungsablesungen, die HLA-A, -B und -C kartieren, aus RNA-Sequenzierungsdaten von Flo-1-Zellen (Daten nicht gezeigt).Peptidsequenzen, die mit der Sequenzierungsablesung übereinstimmten, zeigten signifikante Unterschiede zwischen HLA-A, -B und -C in Regionen, in denen sich vernetzte Peptide in HLA-A befanden (Abbildung S3).Darüber hinaus konnten wir keine Protein-zu-Protein-Vernetzung von HLA-B/C-Molekülen mit H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4-Proteinen beobachten.Dies legt nahe, dass die Proteininteraktion zwischen HLA-A, MDN1, LRCH1 und HMGA1 HLA-A-spezifisch ist.Darüber hinaus zeigte die Proteomanalyse nicht vernetzter Proben (Tabelle S4), dass HLA-A im Vergleich zu HLA-B oder HLA-C eine höhere Sequenzabdeckung aufweist.Die für HLA-A identifizierten Peptide waren sowohl in IFNα-behandelten als auch in unbehandelten Proben von hoher Intensität.
Um sicherzustellen, dass die hier identifizierten Wechselwirkungen nicht auf eine unspezifische Vernetzung zweier Proteine ​​in unmittelbarer räumlicher Nähe zurückzuführen sind, haben wir außerdem zwei neue HLA-A-Interaktionsfaktoren durch die Durchführung von Co-Immunpräzipitationstests bestätigt.HLA-A-Wechselwirkungen mit endogenem MDN1 und H2B wurden sowohl in IFNα-behandelten als auch in unbehandelten Flo-1-Zellen nachgewiesen (Abbildung 7, Abbildung S4).Wir bestätigten, dass HLA-A durch H2B in den Immunpräzipitaten eingefangen wurde und dass dieser Zusammenhang auf die IFNα-Behandlung zurückzuführen war, da HLA-A in den Immunpräzipitatproben unbehandelter Zellen fehlte (Abbildung 7A).Unsere Daten legen jedoch nahe, dass IFNα die HLA-A-Bindung an H2B und MDN1 unterschiedlich reguliert.IFNα induziert die Assoziation zwischen H2B und HLA-A, verringert jedoch dessen Assoziation mit MDN1.Wir fanden heraus, dass MDN1 in den Kontrollen mit HLA-A assoziiert war und die Zugabe von IFNα diese Wechselwirkung unabhängig von der MDN1-Induktion durch IFNα reduzierte (Abbildung 7B,C).Darüber hinaus hat die HLA-A-Immunpräzipitation H2B in A549-Zellen eingefangen (Abb. S4), was darauf hindeutet, dass diese Wechselwirkung unabhängig vom Zelltyp ist.Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse die Interferon-vermittelten Wechselwirkungen von HLA-A mit H2B und MDN1.
HLA-A reinigt H2B und MDN1 gemeinsam.Repräsentative endogene H2B- (A) und MDN1-Immunoblots (B) wurden aus IFNα-behandelten Flo-1-Zellen immunpräzipitiert und auf die angegebenen Antikörper untersucht.Als Negativkontrolle wurden Maus- und Kaninchen-IgG verwendet.(C) Relative Mengen (Eingabe) verschiedener Antigene werden durch Immunoblots dargestellt, die gegen die angegebenen Antikörper untersucht wurden. β-Actin wurde als Ladungskontrolle verwendet.
Die strukturellen Eigenschaften eines der Interferon-induzierten hochzuverlässigen vernetzten Netzwerke, H2B-HLA-A-HMGA1, wurden untersucht.Als alternativen Ansatz verwendeten wir die Modellierung der Molekulardynamik, um die Konformationsdynamik der an diesem Komplex beteiligten Proteine ​​zu verstehen (Abbildung 8).Schlussfolgerungen aus den CLMS-Daten legen die Möglichkeit unterschiedlicher Konformationen der H2B-, HLA-A- und HMGA1-Proteine ​​nahe.Daher wurden die folgenden potenziellen Komplexe in einem Lösungsmittelmedium modelliert: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A und H2B-HLA-A-HMGA1.Ein erster Protein-Protein-Docking-Screen unter Verwendung des MOE-Pakets (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) deutete auf mögliche Konformationen hin, die sich zwischen diesen Proteinen unterscheiden (Abb. 8A).Die Visualisierung des Docking-Proteinkomplexes zeigte mehrere Wechselwirkungen und mögliche Konformationen (Abbildung 5A, 8).Daher ist eine mögliche Konformation in Abbildung 8A (mit markierten Querverbindungen) dargestellt und wurde mithilfe der MD-Modellierungspipeline weiter bewertet.Darüber hinaus unterstreicht die Bindung von H2B oder HMGA1 an HLA-A die höhere Affinität von H2B für HLA-A (Abb. 8A).
Konformationsdynamik möglicher Netzwerke zwischen den Komplexen H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A und H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Das linke Feld ist eine 2D-Karte (erstellt in der SIM-XL-Software) intramolekularer (rot) und intermolekularer (blau) Vernetzungen (Vernetzungsgrenze auf 3,5 eingestellt).Darüber hinaus werden identifizierte vernetzende Reste auf den Strukturen der H2B-, HLA-A- und HMGA1-Proteine ​​markiert.Die zugehörigen Konformationen dieser Proteine ​​wurden mithilfe der im MOE-Paket implementierten Docking-Pipeline extrahiert.Das untere linke Feld zeigt die verschiedenen möglichen Konformationen der H2B-HLA-A- und HMGA1-HLA-A-Komplexe mit unterschiedlichen Protein-Protein-Bindungsaffinitäten (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standardabweichung (RMSD) der Atompositionen (ohne Wasserstoffatome) für jede Proteinstruktur.(C) Intermolekulare Protein-Protein-Wasserstoffbindungswechselwirkungen aus verschiedenen simulierten Komplexen unter Berücksichtigung spezifischer Wechselwirkungen mit einer Dauer von ≥ 10 ns.Der H-Brücken-Donor-Akzeptor-Grenzabstand wurde auf 3,5 Å und der Donor-H-Akzeptor-Grenzwinkel auf ≥ 160°–180° eingestellt.(D) Markierte Reste, die HLA-A-Protein-Protein-Wechselwirkungen mit ihren jeweiligen Partnern bilden, über einen Zeitraum von ≥ 20 ns, extrahiert aus Dummy-HLA-A-H2B- und HLA-A-HMGA1-Komplexen.Proteinstrukturen repräsentieren eine durchschnittliche Struktur von 100 ns MDS.(E) Wechselwirkungen zwischen HLA-A-H2B- und HLA-A-HMGA1-Komplexen im Vergleich zu Wechselwirkungen, die durch H2B-HLA-Simulation über 100 ns basierend auf der K- oder S-Wechselwirkungsstelle zwischen den beiden Peptiden verfolgt wurden.Komplexe /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Der Schwellenwert für die Bewertung der Vernetzungen wurde auf 3,0 festgelegt und spezifische Interaktionen von MDS mit einer Dauer von ≥ 10 ns wurden berücksichtigt.Proteinstrukturen wurden mit den Paketen BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) und Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) visualisiert.
Die Stabilität von HLA-A-Molekülen über die Zeit (Standardabweichung; RMSD oder Standardabweichung; RMSF) zeigte, dass das Vorhandensein von H2B- oder HMGA1-Proteinen in den Komplexen HLA-A stabilisierte (Abbildung 8B, Abbildung S5).Das HMGA1-Protein bindet fest an die B2M-Stelle von HLA-A und induziert die Stabilität der HLA-A-Aminosäuren im HLA-A-HMGA1- oder H2B-HLA-A-HMGA1-Komplex (Abbildung 8B, Abbildung S5).insbesondere die HLA-Reste ~60–90 und ~180–210 erwiesen sich in Gegenwart von H2B als weniger flexibel (Abb. 8B).H2B und HMGA1 zeigten eine bessere Bindung an HLA-A im H2B-HLA-A-HMGA1-Komplex im Vergleich zur HLA-A-Bindung an H2B oder HMGA1 allein (Abbildung 8C,D; Tabelle S5).An der Wasserstoffbindung beteiligte Reste (MD-modellierte hohe Besetzung ≥ 10 ns) stimmen mit CLMS-Wechselwirkungsstellen (K- oder S-Reste) im Komplex überein, was darauf hindeutet, dass die durch CLMS identifizierten Wechselwirkungen sehr zuverlässig sind.Zuverlässigkeit (Abb. 8E).Bei der CLMS- und MD-Modellierung wurde festgestellt, dass HLA-A-Reste zwischen etwa 190–210 und etwa 200–220 Aminosäuren H2B bzw. HMGA1 binden (Abb. 8E).
Protein-Protein-Wechselwirkungen bilden dynamische strukturelle Netzwerke, die die intrazelluläre Kommunikation als Reaktion auf bestimmte Reize vermitteln.Da viele Proteomik-Ansätze Veränderungen im gesamten Steady-State-Niveau eines Proteins erkennen, erfordert die Dynamik der Protein-Protein-Interaktion zusätzliche Werkzeuge zur Erfassung von Bindungsschnittstellen, und CLMS ist ein solches Werkzeug.Das Interferon-Signalsystem ist ein Zytokin-Netzwerk, das es Zellen ermöglicht, auf eine Reihe umweltpathogener und intrinsischer pathologischer Signale zu reagieren, was in der Induktion von Untergruppen von Interferon-induzierbaren Proteinen gipfelt.Wir haben CLMS angewendet, um festzustellen, ob bei einer Reihe von Interferon-induzierten Proteinen neue Protein-Protein-Wechselwirkungen identifiziert werden konnten.Zur Erfassung von Proteinkomplexen wurde eine globale Proteinvernetzungsanalyse in einem Interferon-responsiven Flo-1-Zellmodell verwendet.Die Extraktion tryptischer Peptide aus nicht vernetzten und vernetzten Zellen ermöglicht die Peptidzählung, Signalweganreicherung und Peptidlängenverteilung mit definierter LFQ-Intensität.Kanonische Interferon-induzierbare Proteine ​​wurden als positive interne Kontrolle identifiziert, während neue intermolekulare und intramolekulare vernetzte Addukte kanonischer Interferon-induzierbarer Proteine ​​wie MX1, UP18, OAS3 und STAT1 beobachtet wurden.Verschiedene Strukturmerkmale und Wechselwirkungen in Funktionsbereichen wurden untersucht.
Eine Interaktion zwischen HLA-A, MDN1 und H2B wurde durch Immunblotting in mit IFNα behandelten und unbehandelten Flo-1- und A549-Zellen nachgewiesen.Unsere Ergebnisse zeigen, dass HLA-A in IFNα-abhängiger Weise Komplexe mit H2B bildet.Unsere Arbeit stellt einen interessanten Weg für die weitere Erforschung der Co-Lokalisierung dieser beiden Komplexe dar.Es wäre auch interessant, den CLMS-Ansatz auf eine Reihe von Zelllinien auszuweiten, um zelltypunabhängige Interferon-vermittelte Proteininteraktionen zu identifizieren.Schließlich nutzten wir MD-Modellierung als alternativen Ansatz, um die Konformationsdynamik von Proteinen zu verstehen, die am H2BFS-HLA-A-HMGA1-Komplex beteiligt sind, wodurch intramolekulare und intermolekulare Kreuzgespräche verfolgt wurden.Schlussfolgerungen aus den CLMS-Daten legen die Möglichkeit unterschiedlicher Konformationen der H2BFS-, HLA-A- und HMGA1-Proteine ​​nahe.Die möglichen unterschiedlichen Konformationen zwischen diesen Docking-Proteinkomplexen zeigten mehrere Wechselwirkungen, die denen im CLMS-Datensatz ähneln.Eine der Hauptstärken unserer Methode besteht darin, dass sie die einfache Identifizierung interagierender hochpolymorpher Gene wie HLA ermöglicht. Daher wird es interessant sein, Interaktionen von HLA-Haplotyp-spezifischen Proteinen zu untersuchen, die ansonsten schwer zu untersuchen sind.Zusammengenommen zeigen unsere Daten, dass CLMS verwendet werden kann, um unser Verständnis von Interferon-induzierten Signalnetzwerken zu erweitern und eine Grundlage für die Untersuchung komplexerer interzellulärer Systeme in der Tumormikroumgebung zu schaffen.
Flo-1-Zellen wurden von ATCC erhalten und in DMEM (Gibco), ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin (Invitrogen), 10 % fötalem Rinderserum (Gibco), gehalten und bei 37 °C und 5 % CO2 gelagert.Inkubation.Die Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 70–80 % gezüchtet, bevor sie mit IFNα14 (hergestellt von der Edinburgh Protein Production Facility) behandelt wurden.Alle anderen Chemikalien und Reagenzien wurden von Sigma Aldrich bezogen, sofern nicht anders angegeben.
Flo-1-Zellen wurden in Platten mit 6 Vertiefungen kultiviert und am nächsten Tag wurden die Zellen 24 Stunden lang mit 10 ng/ml IFNα14 bis zu einer Konfluenz von etwa 80 % behandelt.Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit frisch zubereitetem DSS (Thermo Fisher Scientific) (gelöst in DMSO) in PBS 5 Minuten lang bei 37 °C bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM ligiert.Die DSS-Vernetzungsreaktion wurde durch PBS ersetzt und restliches DSS wurde durch Zugabe von 20 mM Tris (pH 8,0) in PBS für 15 Minuten bei 37 °C gequencht.Die Zellen wurden durch Schaben gesammelt und in Röhrchen mit geringer Bindung (Axygen) gesammelt.
Das Zellpellet wurde mit 300 µl Harnstoff-Lysepuffer (8 M Harnstoff, 0,1 M Tris, pH 8,5) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln lysiert.Alle Zentrifugationsschritte wurden bei 14.000 xg und 8 °C durchgeführt.Zentrifugieren Sie das Lysat 10 Minuten lang und übertragen Sie den Überstand in ein neues Röhrchen.Die verbleibenden klaren Partikel wurden 30 Minuten oder länger in 150 μl des zweiten Lysepuffers (2 M Harnstoff, 2 % (w/v) SDS (Natriumdodecylsulfat)) gelöst, bis eine homogene wässrige Lösung erhalten wurde.Das Lysat wurde 20 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand mit dem im vorherigen Schritt erhaltenen Lysat gemischt.Die Proteinkonzentrationen wurden mithilfe des Micro-BCA-Assays (Thermo Fisher Scientific) gemäß den Anweisungen des Herstellers für Mikroplattenverfahren bestimmt.Die Proben wurden schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
Ungefähr 100 μg lösliches vernetztes Protein wurden unter Verwendung eines modifizierten Filtrationsprobenvorbereitungsprotokolls (FASP) verarbeitet, wie von Wisniewski et al. beschrieben.69 Kurz gesagt, das Protein wird mit 200 µl Harnstoffpuffer (8 M Harnstoff in 0,1 M Tris, pH 8,5) vernetzt, verwirbelt und halbiert.Alle Zentrifugationsschritte wurden bei 14.000 xg und 25 °C durchgeführt.Die erste Hälfte des vernetzten Proteinlysats wurde auf eine 10-kDa-Microcon-Zentrifugalfiltervorrichtung übertragen, die mit einer Ultracel-10-Membran (Merck) ausgestattet war, gefolgt von einer 25-minütigen Zentrifugation auf dem Filter.Geben Sie dann die zweite Hälfte des Proteins in den Filter und wiederholen Sie die gleichen Schritte.Die Proteingewinnung erfolgte durch Zugabe von 100 μl 17 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP) in Harnstoffpuffer.Die Rückgewinnung wurde auf einem Thermomixer bei 600 U/min 30 Minuten lang bei 37 °C gerührt.Darüber hinaus wurde die Säule zentrifugiert und das reduzierte vernetzte Protein mit 100 μl 50 mM Iodacetamid in Harnstoffpuffer alkyliert.Die Alkylierungsreaktion wurde 20 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur durchgeführt.Drehen Sie die Säule, waschen Sie die Säulenwände dreimal mit 100 µl Harnstoffpuffer und zentrifugieren Sie sie anschließend.Der gleiche Vorgang wurde dreimal mit 100 μl 100 mM Ammoniumbicarbonat durchgeführt.Ersetzen Sie vor der Trypsinisierung das Sammelröhrchen durch ein neues.Fügen Sie Verdauungspuffer hinzu, der 50 mM Ammoniumbicarbonat und 1 µl Trypsin enthält, verdünnt in Trypsinpuffer (Promega).Das Verhältnis von Trypsin zu Protein wurde bei etwa 1:33 gehalten und die Verdauungsreaktionen wurden über Nacht bei 37°C in einer feuchten Kammer inkubiert.Das vernetzte Peptid wurde durch 25-minütige Zentrifugation vom Filter eluiert.Die Peptidrückgewinnung wurde durch Zugabe von 50 μl 0,5 M NaCl zum Filter und anschließende 25-minütige Zentrifugation verbessert.
C18 Micro Spin-Säulen (Harvard Apparatus) wurden zum Entsalzen vernetzter tryptischer Peptide nach dem von Bouchal et al.70 beschriebenen Protokoll mit geringfügigen Modifikationen verwendet.Kurz gesagt, C18-Spinsäulen wurden mit drei Wäschen mit 0,1 % Ameisensäure (FA) in Acetonitril (AcN) (Merck) und zwei Wäschen mit 0,1 % FA aktiviert.Die Säule wurde 15 Minuten lang mit 0,1 % FA hydratisiert.Laden Sie Proben in Spin-Säulen und waschen Sie sie dreimal mit 0,1 % FA.Die entsalzten Peptide wurden nacheinander mit einem schrittweisen Gradienten unter Verwendung von 50 %, 80 % und 100 % AcN in 0,1 % FA eluiert.Die Proben wurden in einem SpeedVac Plus-Konzentrator (Eppendorf) getrocknet, bis die Restflüssigkeit vollständig verschwunden war.Die eluierten Peptide wurden in 100 μl 0,08 % Trifluoressigsäure in 2,5 % AcN gelöst und die Konzentrationen wurden auf einem NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) gemessen.Ungefähr 1 μg vernetztes Peptid pro Probe wurde in das LC-MS/MS-System injiziert.
Vernetzte Peptide wurden auf einem UltiMate 3000 RSLCnano LC-System (Thermo Scientific) getrennt, das an ein Orbitrap Exploris 480-Massenspektrometer (Thermo Scientific) angeschlossen war.Vernetzte Peptide wurden auf einer 5 mm langen µ-Vorsäulen-C18-Einfangsäule mit 300 µm Innendurchmesser, gepackt mit C18 PepMap100-Sorbens und 5 µm PepMap-Sorbens (Thermo Scientific), gesammelt.Laden Sie den Pumpenfluss auf 5 µl/min 0,08 % Trifluoressigsäure, gelöst in 2,5 % AcN.Vernetzte Peptide wurden auf einer analytischen Quarzglassäule mit einem Innendurchmesser von 75 μm und einer Länge von 150 mm getrennt, die mit einem 2 μm PepMap-Sorbens (Thermo Scientific) gefüllt war.Die mobilen Phasen A und B bestanden aus 0,1 % FA in Wasser bzw. 0,1 % FA in Acetonitril.Der Gradient beginnt bei 2,5 % B und steigt linear über 90 Minuten auf 40 % B und dann über die nächsten 2 Minuten auf 90 % B an.Die Zusammensetzung der mobilen Phase wurde 10 Minuten lang bei 90 % B gehalten und nahm dann innerhalb von 2 Minuten linear auf 2,5 % B ab.Die Säule wurde vor dem nächsten Zyklus 8 Minuten lang bei 2,5 % B äquilibriert.Aus der Analysesäule eluierte vernetzte Peptide wurden in einer Nanoelektrospray-Ionisationsquelle (NSI) ionisiert und in ein Exploris 480-Massenspektrometer (Thermo Scientific) injiziert.
Das Massenspektrometer Orbitrap Exploris 480 arbeitete im positiven Datenkorrelationsmodus.Ein vollständiger Scan wurde im Schnittmodus mit einer Auflösung von 120.000 und Bereichseinstellungen von m/z 350 Th bis m/z 2000 Th durchgeführt.Das normalisierte AGC-Ziel wurde auf 300 % mit einer maximalen Eingabezeit von 50 ms festgelegt.Für Peptide wurde die Detektion monoisotopischer Peaks etabliert.Der Constraint-Relax-Parameter wird auf „true“ gesetzt, wenn zu wenige Vorläufer gefunden werden.Die minimale Ionenstärke des Vorläufers wurde auf 5,0e3 eingestellt und Ladungszustände des Vorläufers bis zu +8 wurden in die Experimente einbezogen.
Die Zykluszeit zwischen den Hauptscans im Datenkorrelationsmodus wurde auf 2,5 Sekunden eingestellt.Der dynamische Massenausschluss wurde auf 20 s nach der ersten Fragmentierung des Vorläuferions eingestellt.Das Vorläufer-Isolierungsfenster wurde auf 2 Th eingestellt.Der Typ der normalisierten Kollisionsenergie mit einem festen Kollisionsenergiemodus wurde in einem datenabhängigen MS/MS-Scan ausgewählt.Kollisionsenergie auf 30 % eingestellt.Die Orbitrap-Auflösung wurde auf 15.000 und das AGC-Ziel auf 100 % eingestellt.Die benutzerdefinierte maximale Injektionszeit ist auf 60 Millisekunden eingestellt.
Bevor wir das Protein-Protein-Netzwerk in vernetzten Proben verfolgten, verarbeiteten wir die Rohdateien mit dem MaxQuant-Paket (Version 1.6.12.0)26,27, um nachverfolgbare Peptide/Proteine ​​in den Proben zu identifizieren.Darüber hinaus wurden ähnliche Proteomanalysen an unvernetzten Flo-1-Proben durchgeführt, die mit IFNα behandelt und unbehandelt waren.MS/MS-Daten wurden in der UniProt-Menschendatenbank (www.uniprot.org) (hochgeladen am 12. August 2020, enthält 75.093 Einträge) mithilfe der integrierten Suchmaschine Andromeda27 durchsucht.Die Suche wurde ohne Angabe der Spezifität des Enzyms und verschiedener Modifikationen der Desamidierung (N, Q) und Oxidation (M) durchgeführt.Die Massentoleranzen für Vorläufer wurden auf 20 ppm und Produktionen auf 0,02 Da festgelegt.Die anfängliche und maximale Massenabweichung wurde auf 10 ppm eingestellt.Die maximale Masse des Peptids wurde auf 4600 Da und die Sequenzähnlichkeit zwischen 7 und 25 Aminosäuren (aa) festgelegt.Weitere statistische Analysen wurden mit dem Perseus-Programm (Version 1.6.10.45) durchgeführt.Der Proteingehalt wurde durch Normalisierung der spektralen Intensität des Proteins (LFQ-Intensität; unbeschriftete Quantifizierung)27 berechnet und die Intensitätswerte wurden in Log2 umgewandelt.Mithilfe des Pheatmap-Pakets (v1.0.12) in R (v 4.1.2) wurde eine hierarchische Clusterung von Proteinen erstellt, die anhand ihrer Peptidintensität identifiziert wurden.Die Pathway-Anreicherungsanalyse wurde unter Verwendung der Reactome-Pathway-Datenbank für IFNα-behandelte Proteine ​​durchgeführt, die im Vergleich zu unbehandelten Proben mehr als viermal aktiviert wurden.
Die Identifizierung von Lysin (K)- oder Serin (S)-spezifischen chemischen Vernetzungen von Proteinkomplexen, überwacht durch LC-MS/MS, wurde unter Verwendung eines spektroskopischen Identifikationsgeräts (SIM-XL) für vernetzte Peptide (SIM-XL)29 durchgeführt.Zunächst wurden mögliche Wechselwirkungen zwischen Interferon-assoziierten (IFN) DNA Damage Resistance Signature (IRDS)-Genen anhand des in Padariya et al.28 beschriebenen IRDS-Proteindatensatzes untersucht.Das Screening aller Zustände und Wiederholungen des gesamten menschlichen UniProt ist rechenintensiv, daher wird die gesamte menschliche UniProt-Datenbank (www.uniprot.org) (heruntergeladen am 12. August 2020, enthält 75.093 Einträge) gegen IFNα-behandelte Wiederholungen untersucht.Einer der Filter für Interaktionen mit hohem Vertrauen.Diese erhaltenen hochsignifikanten Wechselwirkungen wurden erweitert und in allen Wiederholungen und Bedingungen getestet.
In SIM-XL wurde DSS für den Vernetzer (XL) verwendet und die XL-Gewichtsverlagerung und die Modifikationsgewichtsverlagerung wurden auf 138,06 bzw. 156,07 eingestellt.Die folgenden Vernetzungsreaktionsstellen werden berücksichtigt: KK, KS und KN-TERM, ohne Reporterionen.Sowohl Vorläufer- als auch Fragment-ppm wurden auf 20 und der Xrea-Schwellenwert auf 0,15 eingestellt.Trypsin galt als völlig spezifisch und es wurde eine hochenergetische C-Fallen-Fragmentierungsmethode (HCD) implementiert.Der XCorr-Schwellenwert für die dynamische DB-Reduktion und die Mindestanzahl an Peptiden für die dynamische DB-Reduktion wurden auf 2,5 bzw. 2 festgelegt.Weitere Parameter sind: Monoisotopenwahrscheinlichkeit und Peak-Koinzidenz-Cutoff, mindestens 4 AA-Reste pro Strang und maximale Strangladung sowie 3 Maxima fehlender Teilungen.Die resultierenden zusammengefügten 2D-Karten wurden in (SIM-XL) analysiert und die grafische Darstellung von xQuest28 wurde zum Erstellen der 2D-Karten verwendet.Proteinvernetzungen auf Proteinstrukturen werden in PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC) bereitgestellt.
Proteinmodellstrukturen wurden mit dem Phyre2-Server (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 unter Verwendung der Prinzipien der Homologiemodellierung und der Implementierung der „Hidden-Markov-Methode“ erstellt.Phyre2 generiert Modellstrukturen basierend auf der Sequenzausrichtung mit bekannten Proteinstrukturen.Für die Proteine ​​H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 und MDN1 wurden die Matrizenstrukturen 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 und 6i2665 verwendet.Darüber hinaus wurde auch der Aufbau von AlphaFold71 MX1, UBP18 und ROBO1 berücksichtigt.Die Proteinstruktur wurde mit dem BIOVIA Discovery Studio Visualizer-Paket (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) und dem Molecular Operating Environment-Paket (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) visualisiert.