ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Duplex-geschweißtes Rohr für chemische Komponenten der chemischen Industrie. Ein Mangel an SPECC1L führt zu einer erhöhten Stabilität der Spleißverbindungen und einer verringerten Ablösung kranialer Neuralleistenzellen.

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ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Duplex-geschweißtes Rohr für die chemische Industrie

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ist ein führender Hersteller, der sich auf nahtlose Edelstahlrohre, blankgeglühte Rohre, nahtlose Spiralrohre usw. spezialisiert hat.Um den Kunden die Arbeit zu erleichtern, haben wir auch Rohre und Röhren geschweißt.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.verfügt über modernste Produktions- und Prüfgeräte.Wir können Ihre Anforderungen voll und ganz erfüllen.Nach sehr strengen Standards haben die von uns hergestellten Rohre immer die korrekte Außen- und WT-Toleranz.Die Toleranzkontrolle richtet sich strikt nach den Produktionsstandards.Mit unseren Produkten sind die Kunden stets zufrieden.Kunden, die unsere Produkte kauften, führten zu höheren Gewinnen.
a) AD (Außendurchmesser): 3,18 mm bis 101,6 mm
b) WT (Wandstärke): 0,5 mm bis 20 mm
c) Länge: Je nach Kundenwunsch
d) Standards: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 usw
e) Prozessmethode: ERW, EFW usw

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Die kranialen Neuralleistenzellen (CNCC) lösen sich von den embryonalen Neuralfalten und wandern zu den Rachenbögen, die die meisten Mittelgesichtsstrukturen bilden.Die CNCC-Dysfunktion spielt eine wichtige Rolle bei der Ätiologie der orofazialen Spalte, einer häufigen angeborenen Fehlbildung.Heterozygote SPECC1L-Mutationen wurden bei Patienten mit atypischen und syndromalen Spalten gefunden.Hier berichten wir über eine verstärkte Färbung der Komponenten der kanonischen Klebeverbindung (AJ), β-Catenin und E-Cadherin in kultivierten SPECC1L-Knockdown-Zellen, und elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen die apikal-basale Diffusion von AJ.Um die Rolle von SPECC1L bei der kraniofazialen Morphogenese zu verstehen, haben wir ein Specc1l-defizientes Mausmodell erstellt.Homozygote Mutanten sind embryonal letal und weisen einen gestörten Neuralrohrverschluss und eine beeinträchtigte CNCC-Laminierung auf.Die AJ-Proteinfärbung ist in mutierten Nervenfalten erhöht.Dieser AJ-Defekt steht im Einklang mit einem Fehler bei der CNCC-Delamination, der eine AJ-Auflösung erfordert.Darüber hinaus haben Specc11-Mutanten die PI3K-AKT-Signalübertragung verringert und die Apoptose erhöht.In vitro reichte eine leichte Hemmung des PI3K-AKT-Signals in Wildtyp-Zellen aus, um AJ-Veränderungen auszulösen.Wichtig ist, dass durch den SPECC1L-Knockdown verursachte AJ-Änderungen durch Aktivierung des PI3K-AKT-Signalwegs rückgängig gemacht werden können.Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass SPECC1L als neuartiger Regulator der PI3K-AKT-Signalübertragung und der AJ-Biologie für den Neuralrohrverschluss und die CNCC-Schichtung erforderlich ist.
Craniale Neuralleistenzellen (CNCCs) lokalisieren sich im dorsalen Neuroektoderm und lösen sich vom Neuroepithel der sich entwickelnden Neuralfalten durch einen Prozess, der den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) einschließt1,2,3.Prämigrierende epitheliale CNCCs stören interzelluläre Verbindungen und werden zu migrierenden mesenchymalen CNCCs, die den ersten und zweiten Rachenbogen ausfüllen und den größten Teil des kraniofazialen Knorpels bilden.Daher sind Gene, die die CNCC-Funktion regulieren, häufig in der Ätiologie kraniofazialer angeborener Anomalien wie orofazialen Spalten gestört, was am häufigsten allein in den USA 1/800 Geburten betrifft.Eine der angeborenen Deformitäten8.
Die Delaminierung des CNCC fällt mit dem Verschluss des vorderen Neuralrohrs zwischen 8,5 und 9,5 Tagen der Embryonalentwicklung bei Mäusen zusammen.Mutanten einer Reihe von Genen, die mit orofazialen Spalten der Maus assoziiert sind, weisen ebenfalls irgendeine Form von Neuralrohrdefekten auf, darunter Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 und Pdgfrα12.Die Prozesse des Neuralrohrverschlusses und der CNCC-Schichtung können jedoch als unabhängig betrachtet werden, da die Splotch-Mutantenmaus (Pax3) Defekte beim Neuralrohrverschluss aufweist, ohne dass sich dies auf die CNCC-Schichtung oder -Migration auswirkt 13,14.Zusätzliche Mausmodelle mit Defekten bei der CNCC-Dissektion und dem Neuralrohrverschluss werden dabei helfen, die gemeinsame molekulare Basis dieser beiden Prozesse abzugrenzen.
Die Isolierung von CNCC aus neuroepithelialen Zellen erfordert die Auflösung von Adhäsionsverbindungen (AJs), die aus Proteinkomplexen bestehen, die unter anderem E-Cadherin, β-Catenin, α-E-Catenin und α-Actinin enthalten, die mit Aktinfilamenten assoziiert sind 2 Studien zur Überexpression von E-Cadherin in Nervenfalten zeigten eine Verringerung oder Verzögerung der CNCC-Delamination.Umgekehrt führt die Unterdrückung von E-Cadherin zu einer frühen Schichtung15,16.Viele der Faktoren, die die EMT während der CNCC-Stratifizierung vermitteln, sind Transkriptionsfaktoren (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) und extrazelluläre Matrix (ECM)-Remodellierungsproteine ​​wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs). CNCCs sind jedoch direkte AJ-Regulatoren des Zytoskeletts noch nicht bekannt.Es ist bekannt, dass der PI3K-AKT-Signalweg den E-Cadherin-Spiegel antagonisiert, vor allem aus der Krebsforschung17.Jüngste Studien haben gezeigt, dass der Verlust der PDGFα-basierten PI3K-AKT-Signalübertragung bei Mäusen zu kraniofazialen Anomalien führt, einschließlich Gaumenspalten und Neuralrohrdefekten12.Der Zusammenhang zwischen dem PI3K-AKT-Signalweg und der AJ-Stabilität bei der CNCC-Stratifizierung ist jedoch unklar.
Wir haben SPECC1L zuvor als erstes mutiertes Gen bei zwei Menschen mit einer schweren Spalte identifiziert, die sich vom Mund bis zum Auge erstreckt und als Oblique Cleft (ObFC) oder Tessier-IV18-Spalte bekannt ist.SPECC1L-Mutationen wurden in zwei Familien mit mehreren Generationen mit dem autosomal-dominanten Opitz-G/BBB-Syndrom (OMIM #145410) identifiziert, bei denen die betroffenen Personen Hyperdistanz und Lippen-Kiefer-Gaumenspalte aufwiesen19, und in einer Familie mit Tibi-Überdistanzsyndrom (OMIM #145420)20 .Mehr als die Hälfte der Fälle des Opitz-G/BBB-Syndroms sind X-chromosomal (OMIM #300000) und werden durch Mutationen im MID1-Gen verursacht, das für Protein 22 des Mikrotubuli-assoziierten Zellskeletts kodiert.Wir nehmen an, dass SPECC1L, ebenfalls ein Protein, das mit Mikrotubuli und dem Aktin-Zytoskelett assoziiert ist, die Signalübertragung vermitteln könnte, die für die Umgestaltung des Aktin-Zytoskeletts während der Zelladhäsion und -migration erforderlich ist 18 .Durch In-vitro- und In-vivo-Studien beschreiben wir nun SPECC1L als einen neuartigen Regulator der AJ-Stabilität durch PI3K-AKT-Signalisierung.Auf zellulärer Ebene führte der SPECC1L-Mangel zu einer Abnahme des pan-AKT-Proteinspiegels und einem Anstieg der apikal-basalen Streuung von AJ, der durch chemische Aktivierung des AKT-Signalwegs beseitigt wurde.In vivo zeigen Specc11-defiziente Embryonen einen beeinträchtigten Neuralrohrverschluss und eine reduzierte CNCC-Dissektion.Somit fungiert SPECC1L bei der stark regulierten Zelladhäsions-basierten Signalübertragung, die für die normale CNCC-Funktion während der Gesichtsmorphogenese erforderlich ist.
Um die Rolle von SPECC1L auf zellulärer Ebene zu charakterisieren, verwendeten wir die zuvor beschriebene stabile Osteosarkom-Zelllinie U2OS, der SPECC1L18 fehlt.Diese stabilen U2OS-Zellen mit SPECC1L (kd)-Knockdown wiesen eine moderate (60–70 %) Abnahme der SPECC1L-Transkripte und -Proteine ​​sowie Defekte bei der Migration und Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts auf 18. Im Gegensatz dazu kam es zu einer starken vorübergehenden Abnahme von Es wurde gezeigt, dass SPECC1L zu mitotischen Defekten führt 23 .Bei der weiteren Charakterisierung stellten wir fest, dass unsere stabilen SPECC1L-kd-Zellen ihre Morphologie bei einem sehr hohen Konfluenzgrad veränderten (Abbildung 1).Einzelne Kontrollzellen und kd-Zellen bei geringer Konfluenz sahen ähnlich aus (Abbildung 1A,D).24 Stunden nach der Fusion behielten die Kontrollzellen ihre quaderförmige Form bei (Abb. 1B, E), während sich die SPECC1L-kd-Zellen verlängerten (Abb. 1C, F).Das Ausmaß dieser Veränderung der Zellform wurde durch In-vivo-Live-Bildgebung von Kontrollzellen und kd-Zellen erfasst (Film 1).Um die Rolle von SPECC1L in konfluenten Zellen zu bestimmen, haben wir zunächst seine Expression untersucht.Wir fanden heraus, dass die SPECC1L-Proteinspiegel bei der Fusion anstiegen (Abbildung 1G), wohingegen die SPECC1L-Transkriptspiegel nicht anstiegen (Abbildung 1H).Darüber hinaus sammelte sich mit zunehmender Zelldichte das SPECC1L-Protein an interzellulären Grenzen an (Abb. 2A-E), wobei sich ein Muster mit dem des membranassoziierten β-Catenins überlappte (Abb. 2A'-E').Angesichts der Assoziation von SPECC1L mit dem Aktin-Zytoskelett 18,23 stellten wir die Hypothese auf, dass SPECC1L mit aktinbasierten Klebeverbindungen (AJ) interagiert.
(AF) SPECC1L-Knockdown-Zellen (DF) verlängern sich bei hoher Konfluenz (F) im Vergleich zu Kontroll-U2OS-Zellen (AC).Hier sind drei der sechs Zeitpunkte (T1, T3, T6) dargestellt, die wir für unterschiedliche Zelldichten ausgewählt haben.(G) Western-Blot-Analyse, die zeigt, dass das SPECC1L-Protein bei einem hohen Konfluenzgrad im Vergleich zu einem niedrigen Konfluenzgrad in Kontrollzellen stabilisiert ist.Der Western-Blot von SPECC1L zeigt die erwartete 120-kDa-Bande und eine Bande mit höherem Molekulargewicht, möglicherweise posttranslational modifiziert (*).Die Western-Blot-Analyse wurde unter den gleichen Bedingungen für niedrige und hohe Konfluenz durchgeführt.Bilder, die SPECC1L bei niedriger und hoher Konfluenz zeigen, wurden aus demselben Blot aufgenommen.Der gleiche Blot wurde entfernt und erneut mit β-Actin-Antikörper untersucht.(H) Die quantitative RT-PCR-Analyse zeigte keine signifikanten Veränderungen der SPECC1L-Transkriptmengen.Fehlerbalken stellen SEMs aus vier unabhängigen Experimenten dar.
(AE) Wir haben sechs Zeitpunkte (T1-T6) ausgewählt, die einen Bereich von Zelldichten repräsentieren, um die Zellformanalyse und AJ-Änderungen in U2OS-Zellen mit SPECC1L-Knockdown (kd) zu normalisieren.Die ersten fünf dieser Zeitpunkte umfassten Einzelzellen (T1), 50–70 % Fusion kleiner Zellcluster (T2), Fusion ohne Umformung von kd-Zellen (T3), Umformung von kd-Zellen (T4) und 24-Stunden-Änderungen.in der hinteren Form von kd (T5)-Zellen.Das SPECC1L-Protein war bei T1 (A) überwiegend im Zytoplasma verteilt, seine Akkumulation wurde jedoch zu späteren Zeitpunkten (B–E, Pfeile) an interzellulären Grenzen beobachtet.(FJ) β-Catenin zeigt eine ähnliche Akkumulation an interzellulären Grenzen, die mit dem AJ-Komplex verbunden sind.(A'-E') SPECC1L und β-Catenin zeigen überlappende Färbungen an Zellgrenzen bei hoher Zelldichte (Pfeile).(F'-J') In SPECC1L-kd-Zellen erscheint die β-Catenin-Färbung bei niedriger Zelldichte (F'-H') normal, nimmt jedoch zu, wenn sich die Zellform ändert (I', J'; Pfeile), was darauf hinweist, dass AJ haben sich verändert.Balken = 10 µm.
Anschließend haben wir versucht, die Auswirkung eines SPECC1L-Mangels auf AJ zu bestimmen.Wir verwendeten mehrere AJ-assoziierte Marker, darunter die kanonischen Komponenten F-Actin, Myosin IIb, β-Catenin und E-Cadherin24,25,26,27.Aktin-Stressfasern nahmen in SPECC1L-kd-Zellen zu, wie zuvor beschrieben (Abb. 3A, B) 18 .Mit Aktinfilamenten assoziiertes Myosin IIb zeigte in vitro einen ähnlichen Anstieg der SPECC1L-kd-Zellen (Abb. 3C, D).AJ-assoziiertes β-Catenin bindet an Cadherin an der Zellmembran und zeigt ein normales „Waben“-Expressionsmuster in Kontrollkubozyten (Abb. 3E, G).Interessanterweise zeigten flache Bilder mit konfokaler Mikroskopie bei der Färbung von β-Catenin (Abb. 3E, F) und E-Cadherin (Abb. 3G, H) auf der Zellmembran konfluenter SPECC1L-defizienter Zellen deutliche Muster einer ausgedehnten Färbung.Diese Ausweitung der AJ-assoziierten β-Catenin-Färbung in kd-Zellen war bei der Konfluenz am stärksten ausgeprägt, schien jedoch Veränderungen in der Zellform vorauszugehen (Abb. 2F-J, F'-J').Um die physikalische Natur dieser erweiterten AJ-Färbung zu bestimmen, untersuchten wir Zellgrenzen auf der apikal-basalen Oberfläche von SPECC1L-kd-U2OS-Zellen mittels Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) (Abbildung 3I,J).Im Gegensatz zu Kontrollzellen (Abb. 3I), die separate elektronendichte Bereiche aufwiesen, die auf AJ hinweisen (Pfeile), zeigten kd-Zellen (Abb. 3J) große, zusammenhängende Bereiche mit hoher Elektronendichte, die auf AJ hinweisen, entlang der Apikobasalebene..Darüber hinaus beobachteten wir in Querschnitten ausgedehnte Zellmembranfalten in kd-Zellen (Abb. S1A, B), was das ausgedehnte Muster der β-Catenin- und E-Cadherin-Färbebänder erklärt (Abb. 3F, H).Zur Unterstützung der Rolle von SPECC1L in AJs wurde β-Catenin zusammen mit SPECC1L in Lysaten konfluenter U2OS-Zellen immunpräzipitiert (Abb. 3K).Zusammen mit der erweiterten Immunfärbung für AJ-Marker stimmte die TEM-Analyse mit unserer Hypothese überein, dass ein SPECC1L-Mangel die apikal-basale AJ-Dichte und -Varianz erhöht.
(AH) Erhöhte F-Actin-Färbung in kd-Zellen 48 Stunden nach der Fusion (T6; A, B).Veränderte Färbung von Myosin IIb im Zusammenhang mit F-Aktin (C, D).Das glatte Muster der β-Catenin- und E-Cadherin-Membranfärbung in Kontrollzellen (E, G) wurde in SPECC1L-kd-Zellen (F, H) verstärkt.Balken = 10 µm.(I–J) Elektronenmikroskopische Aufnahmen der apikal-basalen interzellulären Verbindung.Kontrollzellen zeigen ausgeprägte elektronendichte Regionen, die auf klebrige Verbindungen hinweisen (I, Pfeile).Im Gegensatz dazu schien die gesamte apikal-basale Verbindung in SPECC1L-kd-Zellen elektronendicht zu sein (J, Pfeile), was auf eine erhöhte Dichte und Streuung der Klebeverbindungen hinweist.(K) β-Catenin wurde zusammen mit SPECC1L in konfluenten U2OS-Zelllysaten immunpräzipitiert.Von einem Punkt aus aufgenommenes Bild, das eines von vier unabhängigen Experimenten darstellt.
Um die Rolle von SPECC1L bei der kraniofazialen Morphogenese zu verstehen, haben wir ein Specc1l-defizientes Mausmodell unter Verwendung zweier unabhängiger ES-Trap-Zelllinien, DTM096 und RRH048 (BayGenomics, CA), erstellt, die Intron 1 darstellen, und Specc1l-Transkripte wurden bei 15 erfasst (Abb. 1). .4A, Abbildung S2).Der genomische Ort des Täuschungsvektor-Inserts wurde durch Sequenzierung des gesamten Genoms bestimmt und durch PCR bestätigt (Abb. S2).Beide Genfallendesigns ermöglichten auch die In-Frame-Fusion der Specc11-lacZ-Reporter beim Einfangen.Daher wurde die durch X-Gal-Färbung bestimmte lacZ-Expression als Indikator für die Specc11-Expression verwendet.Beide Allele zeigten ähnliche lacZ-Expressionsmuster, wobei die DTM096-Genfalle in Intron 1 eine stärkere Expression zeigte als RRH048 in Intron 15 (nicht gezeigt).Allerdings ist Specc1l weit verbreitet, mit besonders starker Expression in den Neuralfalten bei E8.5 (Abbildung 4B), im Neuralrohr und in den Gesichtsfortsätzen bei E9.5 und E10.5 (Abbildung 4C,D) sowie in sich entwickelnden Gliedmaßen bei E10.5 und Augen (Abbildung 4D).Wir haben zuvor berichtet, dass die SPECC1L-Expression im ersten Rachenbogen bei E10.5 im Epithel und im darunter liegenden Mesenchym 18 vorhanden war, was mit der CNCC-Linie übereinstimmt.Um die SPECC1L-Expression in CNCC zu testen, führten wir E8.5-Neuralfalten (Abbildung 4E-J) und E9.5-Schädelschnitte (Abbildung 4K-) durch.Bei E8,5 färbte SPECC1L Nervenfalten intensiv (Abb. 4E, H), einschließlich mit NCC-Markern gefärbter Zellen (Abb. 4G, J).Bei E9.5 färbte SPECC1L (Abb. 4K, N) stark wanderndes CNCC, das gleichzeitig mit AP2A (Abb. 4L, M) oder SOX10 (Abb. 4O, P) gefärbt war.
(A) Schematische Darstellung des Specc11-Gens der Maus, das die Insertion des Täuschungsvektors in die Zellklone ES DTM096 (Intron 1) und RRH048 (Intron 15) zeigt.(BD) lacZ-Färbung heterozygoter Specc1lDTM096-Embryonen, die die Specc1l-Expression von E8.5 bis E10.5 darstellen.NE = Neuroektoderm, NF = Neuralfalte, PA1 = erster Rachenbogen.(EP) SPECC1L-Immunfärbung mit den NCC-Markern AP2A und SOX10 in E8.5 (NF; EJ) Nervenfalten und E9.5 (KP) Schädelabschnitten.Eine SPECC1L-Färbung wurde häufig in den Nervenfalten E8.5 (E, H; Pfeilspitzen) beobachtet, einschließlich Zellen, die mit AP2A (F, G; Pfeilspitzen) und SOX10 (I, J; Pfeilspitzen) markiert waren.Bei E9.5 färbte SPECC1L stark wandernde CNCCs (K, N; Pfeile), die mit AP2A (L, M; Pfeile) und SOX10 (O, P; Pfeile) markiert waren.
Die Kreuzung zwischen heterozygoten Specc1lDTM096/+- und Specc1lRRH048/+-Mäusen zeigt, dass die beiden Gen-Trap-Allele nicht komplementär sind und dass zusammengesetzte Heterozygoten und embryonale Homozygoten für jedes Gen-Trap-Allel embryonal letal sind (Tabelle S1).Mendelsche Verhältnisse deuteten auf einen Rückgang der Überlebensrate von Heterozygoten bei der Geburt hin (erwartet 1,34 vs. 2,0).Wir stellten eine niedrige perinatale Mortalität bei Heterozygoten fest, einige hatten kraniofaziale Anomalien (Abb. S3).Die geringe Penetranz dieser perinatalen kraniofazialen Phänotypen erschwert jedoch die Untersuchung ihrer zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen.Daher konzentrierten wir uns auf den embryonalen letalen Phänotyp homozygoter Specc11-Mutanten.
Die meisten zusammengesetzten heterozygoten oder homozygoten Specc1lDTM096/RRH048-Mutantenembryonen entwickelten sich nach E9.5–10.5 nicht (Abb. 5A–D), und das Neuralrohr schloss sich nicht anterior (Abb. 5B, D) und manchmal auch posterior (nicht gezeigt). ..Dieser kraniale Neuralrohrverschlussdefekt war damit verbunden, dass der Großteil des CNCC-markierten DLX2 in den Neuralfalten bei E10,5 verblieb, was auf keine Dissektion hindeutet (Abbildung 5A'-D').Um festzustellen, ob die Gesamtgröße von CNCC ebenfalls verringert wurde, haben wir CNCC-Linien mit GFP in unseren Genfallenlinien mit Wnt1-Cre und ROSAmTmG markiert.Wir streamen sortiertes GFP+ NCC und GFP- (RFP+) Nicht-NCC aus ganzen Embryonen.Bei E9.5 änderte sich der Anteil der durchflusssortierten GFP-markierten CNCCs zwischen WT und mutierten Embryonen (nicht gezeigt) nicht signifikant, was auf eine normale CNCC-Spezifikation hinweist.Daher haben wir die Hypothese aufgestellt, dass die verbleibende Wnt1-Cre- und DLX2-Färbung in freiliegenden Nervenfalten (Abbildung 5B') auf eine fehlerhafte CNCC-Schichtung zurückzuführen ist, möglicherweise aufgrund einer erhöhten Dichte oder Dispersion von AJ-Zellen, wie in SPECC1L-kd-Zellen zu sehen ist.Wir verwendeten die NCC-Marker SOX10, AP2A und DLX2, um das Vorhandensein von CNCC in der Nervenfalte zu bestätigen (Abbildung 5E-R).Bei E8.5 wurde eine Neuralfaltenfärbung für alle drei NCC-Marker in Abschnitten von WT (Abb. 5E, G, I) und Specc1l-Mutante (Abb. 5F, H, J) beobachtet.Während bei E9.5 NCC-Marker wanderndes NCC in WT-Schnitten färbten (Abb. 5M, O, Q), wurde eine restliche NCC-Färbung in freiliegenden Nervenfalten von Specc1l-mutierten Embryonen beobachtet (Abb. 5N, P, R).Da SOX10 und DLX2 migrierende CNCCs markieren, deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass SPECC1L-defiziente CNCCs die postmigratorische Spezifikation erreichen, aber nicht aus neuronalen Falten migrieren.
Ein Specc11-Mangel führt zu einem fehlerhaften Verschluss des Neuralrohrs, einer Delamination von kranialen Neuralleistenzellen und AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo, der wandernde kraniale Neuralkammzellen (CNCC) trägt, markiert mit Wnt1-Cre (A').Im Gegensatz dazu zeigen Specc11-mutierte Embryonen offene Nervenfalten (B, Pfeilspitzen) und CNCCs, die nicht gewandert sind (B', Pfeilspitzen).(C, D') Hellfeldbilder (C, D') und Immunfärbung (C', D') des CNCC-Markers DLX2 von E10.5 WT-Embryonen (C, C') und Specc1l (D, D').In WT E10.5-Embryonen besiedeln DLX2-positive CNCC die Kiemenbögen (C‘, Pfeile), während bei Mutanten eine auffällige Färbung in den offenen Neuralfalten (D‘, Pfeile) und in den ersten Rachenbögen (D‘, Pfeile) bestehen bleibt. Pfeile).) mit einigen Flecken (Pfeile), die auf eine schlechte Delaminierung und Migration von CNCC hinweisen.ER) Abschnitte von mutierten WT- und Specc1l-Embryonen in den Stadien E8.5 (E–L) und E9.5 (M–R) wurden mit den NCC-Markern SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) und DLX2 (I, J, Q, R).Bei E8,5 wurde eine NCC-Färbung in Wildtyp-Neuralfalten (NF) und Mutantenschnitten beobachtet.Die gleichzeitige Färbung von SOX10 und β-Catenin in E8.5 WT (K) und der Mutante (L) ergab eine erhöhte β-Catenin-Färbung an Zellgrenzen in den Nervenfalten.Bei E9.5 wurde eine Wildtyp-Färbung wandernder CNCCs (M, O, Q) beobachtet, während in Mutanten nicht geschichtete CNCCs offene Nervenfalten färbten (N, P, R).(S–Z) In-vivo-AJ-Markierungsanalyse in koronalen Schnitten von WT- und Specc11DTM096/RRH048-Embryonen mit der E9.5-Mutation.In der oberen rechten Ecke ist eine ungefähre Schnittebene dargestellt.In Schnitten mutierter Gewebe wurde eine erhöhte Färbung von F-Actin (S, T) und Myosin IIb (U, V) beobachtet.Ähnlich wie bei den In-vitro-Ergebnissen in Abb. 3 wurde bei mutierten Embryonen eine verstärkte Membranfärbung für β-Catenin (W, X) und E-Cadherin (Y, Z) beobachtet.(AA-BB) Eine elektronenmikroskopische Aufnahme eines Abschnitts eines Wildtyp-Embryos, der über die Grenze der apikalen Basalzelle hinausblickt, zeigt einen ausgeprägten elektronendichten Bereich, der auf adhäsive Verbindungen hinweist (AA, Pfeile).Im Gegensatz dazu ist in Abschnitten von Specc11-Mutantenembryonen (BB, Pfeile) die gesamte apicobasale Verbindung elektronendicht, was auf eine erhöhte Dichte und Streuung der Klebeverbindungen hinweist.
Um unsere Hypothese zu testen, dass eine verringerte Schichtung auf verändertes AJ zurückzuführen ist, untersuchten wir die AJ-Markierung in freiliegenden Nervenfalten von Specc1l-mutierten Embryonen (Abb. 5S-Z).Wir beobachteten einen Anstieg der Aktin-Stressfasern (Abb. 5S, T) und eine damit einhergehende erhöhte Lokalisierung der Myosin-IIB-Färbung auf Aktinfasern (Abb. 5U, V).Wichtig ist, dass wir eine erhöhte Färbung von β-Catenin (Abb. 5W, X) und E-Cadherin (Abb. 5Y, Z) an interzellulären Grenzen beobachteten.Wir untersuchten auch die β-Catenin-Färbung von NCC in den Nervenfalten von E8.5-Embryonen (Abb. 5K, L).Die β-Catenin-Färbung schien in Nervenfalten der Specc1l-Mutante stärker zu sein (Abb. 5L und K), was darauf hindeutet, dass AJ-Veränderungen begonnen hatten.In elektronenmikroskopischen Aufnahmen von Schädelabschnitten von E9.5-Embryonen beobachteten wir erneut eine erhöhte diffuse elektronendichte Färbung bei Specc1l-mutierten Embryonen im Vergleich zu WT (Abb. 5AA, BB und S1E-H).Zusammengenommen stützen diese Ergebnisse unsere In-vitro-Ergebnisse in SPECC1L-kd-U2OS-Zellen und legen nahe, dass eine abweichende AJ-Färbung der CNCC-Stratifizierung in unseren mutierten Embryonen vorausgeht.
Angesichts der bekannten antagonistischen Beziehung zwischen AKT-Aktivität und E-Cadherin-Stabilität17,28 vermuteten wir die Beteiligung der PI3K-AKT-Signalübertragung.Darüber hinaus beobachteten wir bei einigen unserer mutierten Embryonen eine subepidermale Blasenbildung, die der Letalität (<5 %) bei E9,5–10,5 entgingen und sich stattdessen bei etwa E13,5 niederließen (Abb. S3).Subepidermale Vesikel sind ein Kennzeichen einer reduzierten PI3K-AKT-Signalübertragung auf Basis von PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) berichteten, dass eine Störung der PDGFRα-basierten PI3K-Aktivierung in mutierten PdgfraPI3K/PI3K-Embryonen zu subepidermalen Vesikeln, Neuralrohrdefekten und Gaumenspalten-Phänotypen führt.Tatsächlich wurden die Spiegel an pan-AKT und aktivem phosphoryliertem Ser473-AKT in vivo in Specc1l-Mutantengeweben auf den embryonalen Stillstand E9.5 reduziert (Abb. 6A-D).Die Abnahme der Spiegel an phosphoryliertem Ser473-AKT kann vollständig auf die Abnahme der Spiegel an pan-AKT in vivo (Abb. 6E) und in vitro (Abb. 6F) zurückzuführen sein.Eine In-vitro-Abnahme wurde nur beobachtet, wenn U2OS-Zellen stark konfluent waren und sich die Zellform und die AJ-Dichte änderten (Abbildung 6D).Unsere Daten legen daher nahe, dass SPECC1L ein neuartiger positiver Regulator der PI3K-AKT-Signalübertragung bei der kraniofazialen Morphogenese ist.
(A–E) Schädelschnitte E8.5 (A,B) und E9.5 (C,D) oder E9.5-Lysate von Specc1l-Mutantenembryonen (E), die Konzentrationen an aktivem phosphoryliertem S473-AKT und Pan-AKT-Proteinreduktion zeigen , im Vergleich zur Kontroll-WT.Unter den gleichen Bedingungen wurde Western Blot an Wildtyp-Lysaten und Mutanten-Lysaten durchgeführt.Die für SPECC1L gezeigten Bilder wurden von einem Blot aufgenommen.Der gleiche Blot wurde entfernt und erneut mit Anti-Pan-ACT- und β-Actin-Antikörpern untersucht.Die Pan-AKT-Spiegel in E8.5-Neuralfalten (A, B) und die Mengen an phosphoryliertem S473-AKT in E9.5-Schädelabschnitten waren signifikant reduziert.(F) Die Pan-AKT-Spiegel wurden in Lysaten von SPECC1L-kd-U2OS-Zellen, die bei hoher Konfluenz geerntet wurden, ähnlich reduziert.Fehlerbalken stellen SEMs aus drei unabhängigen Western-Blot-Quantifizierungen dar.(GJ) Abschnitte von WT-Embryonen bei E9.5, gefärbt mit KI67 bzw. gespaltener Caspase 3, zeigen Zellproliferation (G, G') und geringe apoptotische Aktivität (H, H').Specc11-mutierte Embryonen zeigen eine vergleichbare Zellproliferation (I), aber die Anzahl der Zellen, die Apoptose durchlaufen, ist deutlich erhöht (J).
Anschließend untersuchten wir Marker für Proliferation und Apoptose.Wir beobachteten keinen Unterschied in der Proliferation von E9.5-Embryonen (Abb. 6E, G im Vergleich zu I), mit einem Proliferationsindex von 82,5 % für WT-Mutanten und 86,5 % für Specc1l-Mutanten, gemessen durch KI67-Färbung (p <0,56, Fisher's). genauer Test).Ebenso konnten wir keinen Unterschied in der Apoptose beobachten, gemessen durch Anfärben auf gespaltene Caspase 3 in Nervenfalten bei E8,5 bis zum Stillstand des Embryos (nicht gezeigt) (nicht gezeigt).Im Gegensatz dazu war die Apoptose in allen E9.5-mutierten Embryonen signifikant erhöht (Abb. 6F, H und J).Dieser allgemeine Anstieg der Apoptose steht im Einklang mit einer verringerten PI3K-AKT-Signalübertragung und einer frühen embryonalen Letalität29,30,31.
Um als nächstes eine kausale Rolle für die PI3K-AKT-Signalübertragung bei AJ-Veränderungen in unseren kd-Zellen zu bestätigen, haben wir den Signalweg in Kontroll- und kd-Zellen chemisch verändert (Abbildung 7A-F).Als Marker verwendeten wir den in konfluenten SPECC1L-kd-Zellen beobachteten Zellformänderungsphänotyp, den wir anhand des Verhältnisses der längsten Abmessung (Länge) zur entsprechenden vertikalen Abmessung (Breite) quantifizierten.Für relativ runde oder quaderförmige Zellen wird ein Verhältnis von 1 erwartet (Abbildung 7G).Zusätzlich zur Zellform haben wir auch die Wirkung auf AJ durch β-Catenin-Färbung bestätigt (Abb. 7A'-F').Die Hemmung des PI3K-AKT-Signalwegs durch Wortmannin reichte aus, um die Zellform in Kontrollzellen (Abbildung 7A,C) und AJ (Abbildung 7A') zu verändern.Der PI3K-AKT-Aktivator SC-79 hatte keinen Einfluss auf die Zellform (Abb. 7A, E) oder die AJ-Expansion (Abb. 7A') in Kontrollzellen.In SPECC1L-kd-Zellen führte eine weitere Unterdrückung des PI3K-AKT-Signalwegs zu einer erhöhten Apoptose (Abb. 7B, D) und einem deutlichen Anstieg der β-Catenin-Färbung (Abb. 7B'), was mit unseren schweren In-vivo-Mutanten übereinstimmt.Wichtig ist, dass die Aktivierung des PI3K-AKT-Signalwegs die Zellform (Abbildung 7B,F) und die AJ-Phänotypen (Abbildung 7B“) deutlich verbesserte.Änderungen der Zellform wurden als Zellrundheitsverhältnis (CCR) quantifiziert und wie oben beschrieben auf Signifikanz verglichen (Abb. 7G).In Kontrollzellen (Abb. 7G, CCR = 1,56) reichte die Behandlung mit Wortmannin tatsächlich aus, um die Zellform (Abb. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) in einem ähnlichen Ausmaß wie beobachtet signifikant zu verändern in SPECC1L.-kd-Zellen (Abb. 7G, CCR = 3,46).Die Wortmannin-Behandlung von SPECC1L-kd-Zellen (Abb. 7G, CCR = 3,60, vernachlässigbar) war nicht signifikanter als unbehandelte kd-Zellen (Abb. 7G, CCR = 3,46, vernachlässigbar) oder mit Wortmannin behandelte Kontrollzellen (Abb. 7G)., CCR = 3,46, vernachlässigbar) beeinflusst zusätzlich die Zelldehnung (7G, CCR = 3,61, vernachlässigbar).Am wichtigsten ist, dass der SC-79 AKT-Aktivator den verlängerten Phänotyp von SPECC1L-kd-Zellen wiederherstellte (Abb. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Diese Ergebnisse bestätigen, dass SPECC1L die PI3K-AKT-Signalübertragung reguliert und legen nahe, dass eine moderate Abnahme von SPECC1L die Zelladhäsion beeinflusst, während eine starke Abnahme zur Apoptose führt (Abb. 8).
(A–F') Kontrollzellen (A, C, E) und SPECC1L-kd-Zellen (B, D, F), behandelt mit PI3K-AKT-Signalweg-Inhibitor Wortmannin (C, D) oder SC-79-Aktivator (E, F). .Unbehandelte Kontrollzellen sind quaderförmig (A) mit normaler β-Cat-Zellfärbung (A'), während kd-Zellen verlängert sind (B) mit erhöhter β-Cat-Zellfärbung (B').Nach der Unterdrückung des PI3K-AKT-Signalwegs verlängerten sich die Kontrollzellen (C) mit β-Cat-Expansion (C'), während kd-Zellen begannen, Apoptose zu durchlaufen (D), ähnlich wie unsere stark mutierten Embryonen und mit extrem verstärktem β-Cat.Färbung (D').Nach der Aktivierung des PI3K-AKT-Signalwegs blieben die Kontrollzellen quaderförmig (E) und wiesen eine normale β-Cat-Färbung (E‘) auf, während kd-Zellen eine deutlich verbesserte Zellform (F) und β-Cat-Färbung (F‘) zeigten, was darauf hindeutet (G) Der Grad der Zellformänderung in (AF) wurde mithilfe des Zellrundheitsverhältnisses (CCR) der längsten Dimension (Länge) und der entsprechenden vertikalen Dimension (Breite) mithilfe der MetaMorph-Software quantifiziert.Unbehandelte (NT) SPECC1L-kd-Zellen (CCR = 3,46) waren signifikant länger als Kontrollzellen (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Die Hemmung des PI3K-AKT-Signalwegs durch Wort in Kontrollzellen reichte aus, um eine ähnliche Verlängerung der Zellform zu bewirken (CCR=3,61, p<2,4×10-9).In ähnlicher Weise stellte die AKT-Aktivierung durch SC-79 in SPECC1L-kd-Zellen die Zellverlängerung auf Kontrollniveau wieder her (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).Die Behandlung von SPECC1L-kd-Zellen mit Wortmannin führte zu einer erhöhten Apoptose, aber keiner weiteren Zunahme der Zellformveränderung (CCR=3,60) im Vergleich zu unbehandelten kd-Zellen (CCR=3,46, ns) oder mit Wortmannin behandelten Kontrollzellen (3,61), die in beobachtet wurden.ns = egal.Dargestellt sind +/- SEM-Messungen für 50 Zellen.Statistische Unterschiede wurden mithilfe des Student-t-Tests berechnet.
(A) Schematische Darstellung der Hemmung und Aktivierung des PI3K-AKT-Signalwegs, die zu AJ-Änderungen bzw. -Rettung führt.(B) Vorgeschlagenes Modell für die AKT-Proteinstabilisierung durch SPECC1L.
Prämigratorische CNCCs erfordern eine AJ-Lyse, um sich von den Neuroepithelzellen der vorderen Neuralfalte zu trennen1,15,32.Eine erhöhte Färbung von AJ-Komponenten und ein Verlust der asymmetrischen apikal-basalen AJ-Verteilung in SPECC1L-defizienten Zellen sowohl in vitro als auch in vivo sowie die physikalische Nähe von SPECC1L zu β-Catenin legen nahe, dass SPECC1L die Funktion hat, die lokale AJ-Stabilität ordnungsgemäß aufrechtzuerhalten Organisationsmuskeln.Aktin-Zytoskelett.Die Assoziation von SPECC1L mit dem Aktin-Zytoskelett und β-Catenin und die Zunahme der Anzahl kondensierter Aktinfilamente in Abwesenheit von SPECC1L steht im Einklang mit der beobachteten Zunahme der AJ-Dichte.Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass eine erhöhte Anzahl von Aktinfasern in SPECC1L-defizienten Zellen zu einer Veränderung der interzellulären Spannung führt.Da zellulärer Stress die Dynamik von AJ 33 beeinflusst, können Spannungsänderungen zu diffuserem AJ 34 führen.Daher wirken sich alle Änderungen auf die CNCC-Ebenen aus.
Wnt1 wird in den frühen Nervenfalten exprimiert, aus denen Zellen der Neuralleiste entstehen.Somit markiert die Wnt1-cre-Abstammungsverfolgung sowohl NCC35 vor als auch vor der Migration.Allerdings markiert Wnt1 auch dorsale Hirngewebeklone, die ebenfalls aus frühen Nervenfalten stammen 35,36, was es wahrscheinlich macht, dass unsere Färbung von E9.5-Mutanten für Wnt1-Marker in offenen Nervenfalten kein CNCC ist.Unsere positive Färbung der NCC-Marker AP2A und SOX10 bestätigte, dass die freigelegten Nervenfalten von Specc11-mutierten Embryonen tatsächlich CNCC enthielten.Da AP2A und SOX10 außerdem Marker für früh migrierende NCC sind, deutete eine positive Färbung darauf hin, dass es sich bei diesen Zellen um postmigratorische CNCC handelt, die nicht durch E9.5 geschichtet werden können.
Unsere Daten legen nahe, dass die molekulare Regulation von AJ durch SPECC1L durch die PI3K-AKT-Signalübertragung vermittelt wird.Die AKT-Signalübertragung ist in SPECC1L-defizienten Zellen und Geweben reduziert.Erkenntnisse von Fantauzzo et al.unterstützen eine direkte Rolle der PI3K-AKT-Signalübertragung bei der kraniofazialen Morphogenese.(2014) zeigten, dass die fehlende Aktivierung des PDGFRα-basierten PI3K-AKT-Signals zu einem Gaumenspalten-Phänotyp führt.Wir zeigen auch, dass die Hemmung des PI3K-AKT-Signalwegs ausreicht, um AJ und Zellform in U2OS-Zellen zu verändern.In Übereinstimmung mit unseren Erkenntnissen haben Cain et al.37 zeigte, dass eine Herunterregulierung der PI3K-α110-Untereinheit in Endothelzellen zu einem ähnlichen Anstieg der perizellulären β-Catenin-Färbung führt, der als Anstieg des „Konnektivitätsindex“ bezeichnet wird.Allerdings führt die Unterdrückung des PI3K-AKT-Signalwegs in Endothelzellen, deren Aktinfilamente bereits hoch organisiert sind, zu einer lockeren Zellform.Im Gegensatz dazu zeigten SPECC1L-kd-U2OS-Zellen eine längliche Zellform.Dieser Unterschied kann zelltypspezifisch sein.Während die Unterdrückung der PI3K-AKT-Signalübertragung das Aktin-Zytoskelett dauerhaft beeinflusst, wird die Auswirkung auf die Zellform durch Spannungsänderungen bestimmt, die durch Änderungen in der Dichte und Organisation der zentralen Aktinfasern verursacht werden.In U2OS-Zellen verwendeten wir nur Zellformänderungen als Marker für die AJ-Änderung und -Erholung bei SPECC1L-Mangel.Zusammenfassend gehen wir davon aus, dass die Hemmung des AKT-Signalwegs bei SPECC1L-Mangel die AJ-Stabilität erhöht und die Delaminierung bei CNCC verringert.
Interessanterweise waren die pan-AKT-Spiegel in vitro und in vivo zusätzlich zu den phosphorylierten 473-AKT-Spiegeln in Abwesenheit von SPECC1L reduziert, was auf eine Regulierung der PI3K-AKT-Signalübertragung auf der Ebene der AKT-Proteinstabilität oder des AKT-Proteinumsatzes schließen lässt.Die SPECC1L- und MID1-Gene, die beide mit dem Opitz/GBBB-Syndrom assoziiert sind, kodieren Proteine, die Mikrotubuli stabilisieren 18,22.Der Mechanismus, durch den SPECC1L und MID1 die Stabilisierung der Mikrotubuli vermitteln, ist nicht vollständig geklärt.Im Fall von SPECC1L umfasst diese Stabilisierung eine verstärkte Acetylierung einer Untergruppe von Mikrotubuli 18 .Es ist möglich, dass SPECC1L einen ähnlichen Mechanismus verwendet, um andere Proteine ​​wie AKT zu stabilisieren.Es wurde gezeigt, dass die Acetylierung von Lysinresten im AKT-Protein zu einer Verringerung der Membranlokalisierung und Phosphorylierung führt38.Darüber hinaus ist für die Membranlokalisierung und -aktivierung eine Ubiquitinierung der K63-Kette am selben Lysinrest auf AKT erforderlich .Unter mehreren Faktoren, die mit SPECC1L-Proteinen interagieren, die in verschiedenen Hochdurchsatz-Hefe-Zwei-Hybrid-Screenings identifiziert wurden, wurden vier – CCDC841, ECM2942, APC und UBE2I43 – über Ubiquitinierung oder Sumoylierung mit dem Proteinumsatz oder der Proteinstabilität in Verbindung gebracht.SPECC1L ist möglicherweise an der posttranslationalen Modifikation von AKT-Lysinresten beteiligt und beeinflusst die AKT-Stabilität.Die entscheidende Rolle von SPECC1L bei der Lokalisierung und Stabilität des AKT-Proteins muss jedoch noch geklärt werden.
Schwere Defekte in der SPECC1L-Expression in vivo führten zu einer erhöhten AJ-Marker-Färbung und einer fehlerhaften CNCC-Überlagerung sowie zu einer erhöhten Apoptose und frühen embryonalen Letalität.Frühere Berichte haben gezeigt, dass Mausmutanten mit erhöhten Apoptosewerten mit Neuralrohrdefekten 44,45,46,47 und kraniofazialen Defekten48 verbunden sind.Es wurde vermutet, dass ein übermäßiger Zelltod in den Neuralfalten oder Rachenbögen dazu führen kann, dass nicht genügend Zellen für eine ordnungsgemäße morphogenetische Bewegung erforderlich sind 48,49,50.Im Gegensatz dazu zeigten unsere SPECC1L-defizienten Zelllinien mit mäßig verringerter SPECC1L-Expression nur AJ-Veränderungen ohne Hinweise auf einen erhöhten Zelltod.Allerdings führte die chemische Hemmung des PI3K-AKT-Signalwegs in diesen Kd-Zellen zu einer erhöhten Apoptose.Somit sichert eine moderate Abnahme der SPECC1L-Expression oder -Funktion das Überleben der Zellen.Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass seltene Specc11-Mutantenembryonen, die dem Arrest in st.E9.5 sind – möglicherweise aufgrund einer verringerten Generfassungseffizienz – in der Lage, ihre Neuralrohre zu schließen und später in der Entwicklung anzuhalten, oft mit kraniofazialen Defekten (Abb. S3).Damit im Einklang steht auch das seltene Vorkommen heterozygoter Specc1L-Embryonen mit kraniofazialen Anomalien – wahrscheinlich aufgrund einer erhöhten Gene Capture-Effizienz – sowie der Befund bei Zebrafischen, bei dem eines der beiden SPECC1L-Orthologe (specc1lb) späte embryonale Phänotypen verursacht, einschließlich des Verlusts von Unterkiefer und bilaterale Spalten51.Daher können heterozygote SPECC1L-Funktionsverlustmutationen, die bei menschlichen Patienten identifiziert wurden, geringfügige Beeinträchtigungen der SPECC1L-Funktion während der kraniofazialen Morphogenese verursachen, die ausreichen, um ihre orofazialen Spalten zu erklären.Die SPECC1L-basierte Regulierung interzellulärer Kontakte könnte auch eine Rolle bei der Palatogenese und der Fusion der Rachenbögen spielen.Weitere Studien zur SPECC1L-Funktion werden dazu beitragen, die Rolle temporärer interzellulärer Kontakte bei CNCC während des Neuralrohrverschlusses bei der Motilität neuroepithelialer Zellen und der kraniofazialen Morphogenese aufzuklären.
U2OS-Osteosarkomkontrolle und SPECC1L-kd-Zellen wurden bereits beschrieben (Saadi et al., 2011).Auch Antikörper gegen SPECC1L wurden bereits früher charakterisiert (Saadi et al., 2011).Anti-β-Catenin-Antikörper (Kaninchen; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (Maus; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), Myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-Cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colorado), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornien), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), Phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), gespaltene Caspase 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) und β-Aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) wurde wie beschrieben verwendet..Aktinfilamente wurden mit Acti-stain Rhodamin-Phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado) gefärbt.
U2OS-Kontrollzellen und SPECC1L-kd-Zellen wurden in Standard-DMEM mit hohem Glucosegehalt, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Life Technologies, Carlsbad, CA), kultiviert.Für AJ-Änderungen wurden 2 x 105 Zellen auf Glas ausgesät, das mit 0,1 % Schweinegelatine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) behandelt wurde, und auf Veränderungen in der Zellform beobachtet.Die Zellen wurden zu verschiedenen angegebenen Zeitpunkten gesammelt: 4 Stunden nach der Aussaat (t = 1), 24 Stunden nach der Aussaat (t = 2), Konfluenz ohne Änderung der Zellform (t = 3), Änderung der Zellform (t = 4). , 24 h nach Zellformänderung (t = 5) und 48 h nach Zellformänderung (t = 6) (Abb. 1, 2, 3).Um den PI3K-AKT-Signalweg zu modulieren, wurden Zellen in den angegebenen Konzentrationen mit dem PI3K-AKT-Inhibitor Wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) oder dem SC-79-Aktivator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota) kultiviert.Das Medium mit den Chemikalien wurde täglich gewechselt.
Unter normalen Kulturbedingungen wurden Bild-für-Bild-Aufnahmen an lebenden Kontroll- und KD-Zellen gemacht und 7 Tage lang alle 10 Minuten Phasenkontrastbilder aufgenommen.Die Bilder wurden mit einem computergesteuerten Leica DM IRB-Umkehrmikroskop aufgenommen, das mit einem mechanischen Tisch und einem 10 × N-PLAN-Objektiv ausgestattet war und an eine QImaging Retiga-SRV-Kamera angeschlossen war.Während der Bildgebung wurden die Zellkulturen bei 37 °C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 gehalten.
Zwei Genfallen-ES-Zelllinien DTM096 und RRH048 vom Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) wurden verwendet, um Specc11-defiziente Mauslinien mit der Bezeichnung Specc1lgtDTM096 und Specc1lgtRRH046 zu erzeugen.Kurz gesagt, 129/REJ-ES-Zellen wurden in C57BL6-Blastozysten injiziert.Die resultierenden chimären männlichen Mäuse wurden mit weiblichen C57BL6-Mäusen gekreuzt, um Nachkommen mit Agouti-Fellfärbung zu identifizieren.Das Vorhandensein von Gen-Trap-Vektor-Inserts wurde zur Identifizierung von Heterozygoten verwendet.Die Mäuse wurden auf einem gemischten Hintergrund aus 129/REJ;C57BL6 gehalten.Die Position der Insertionsstelle des genetischen Fallenvektors wurde durch RT-PCR, Genomsequenzierung und genetische Komplementierung bestätigt (ergänzende Abbildung 1).Um die CNCC-Abstammungslinie von doppelt heterozygoten Specc1lGT-Mäusen zu verfolgen, wurden ROSAmTmG-Mäuse (#007576) und Wnt1-Cre-Mäuse (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) gekreuzt, um das ROSAmTmG- und Wnt1-Cre-Allel in Specc1l-mutierten Embryonen zu produzieren.Alle Experimente an Mäusen wurden gemäß Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee des University of Kansas Medical Center genehmigt wurden.
Die Embryonen wurden 60 Minuten lang bei Raumtemperatur in (1 % Formaldehyd, 0,2 % Glutaraldehyd, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) fixiert.Nach der Fixierung in X-gal-Färbelösung (5 mM Kaliumferricyanid, 5 mM Kaliumferrocyanid, 2 mM MgCl2, 0,01 % Natriumdesoxycholat, 0,02 % NP-40, 1 mg/ml X-gal) wurde die Färbungsentwicklung bei 37 °C durchgeführt .°C innerhalb von 1-6 Stunden.Embryonen wurden in 4 % PFA nachfixiert und sichtbar gemacht.
Für das Western Blot wurden die Zellen in passivem Lysepuffer (Promega, Fitchburg, WI), ergänzt mit einer Mischung aus HALT-Proteaseinhibitoren (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), lysiert.Lysate wurden auf 12 % Polyacrylamid-Mini-PROTEAN TGX-Fertiggelen (Bio-Rad, Hercules, CA) verarbeitet und auf Immobilon PVDF-Membranen (EMD Millipore, Billerica, MA) übertragen.Die Membranen wurden in 5 % Milch in PBS mit 0,1 % Tween blockiert.Die Antikörper wurden über Nacht bei 4 °C oder eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert.Zur Signalerzeugung wurde das Femto SuperSignal West ECL-Reagenz (Thermo Scientific, Waltham, MA) verwendet.Zur Immunfärbung wurden die Embryonen über Nacht in 4 % PFA/PBS fixiert und kryokonserviert.Gewebekryoschnitte wurden in PBS, das 1 % normales Ziegenserum (Thermo Scientific, Waltham, MA) und 0,1 % Triton Nacht.mit Anti-Antikörper und fluoreszierendem Sekundärantikörper (1:1000) für 1 Stunde bei 4°C.Gefärbte Schnitte wurden in ProLong-Goldmedium (Thermo Scientific, Waltham MA) gelegt und flache Bilder wurden unter Verwendung eines konfokalen Leica TCS SPE-Mikroskops erhalten.Jede Immunfärbung wurde als drei unabhängige Experimente an Kreisschnitten von mindestens zwei mutierten Embryonen durchgeführt.Gezeigt wird ein repräsentatives Experiment.
Die Zellen wurden in modifiziertem RIPA-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % Glycerin, 2 mM EDTA und HALT-Proteaseinhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) inkubiert. Kurz gesagt, die Lysate wurden mit Protein-G-Magnetkügelchen (Life Technologies, Carlsbad, CA) vorgereinigt und dann über Nacht bei 4 °C mit Anti-SPECC1L- oder IgG-Protein inkubiert. Zur Extraktion von SPECC1L wurden G-Proteinkügelchen verwendet, und mit dem Anti wurde ein Western-Blot durchgeführt -β-Catenin-Antikörper wie oben beschrieben. Die gezeigten Co-IP-Experimente sind repräsentativ für vier unabhängige Experimente.
Fixierte kultivierte Zellen oder embryonale Mausgewebe wurden dem Elektronenmikroskopiezentrum am University of Kansas Medical Center zur Verfügung gestellt.Kurz gesagt, die Proben wurden in EMbed 812-Harz (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA) eingebettet, über Nacht bei 60 °C polymerisiert und mit einem Leica UC7-Ultramikrotom, das mit einer Diamantklinge ausgestattet war, bei 80 nm geschnitten.Die Schnitte wurden mit einem JEOL JEM-1400 Transmissionselektronenmikroskop sichtbar gemacht, das mit einer 100-kV-Lab6-Kanone ausgestattet war.
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